十六种晋产北柴胡柴胡皂苷含量分析

周 琼，郝建平，高可青，关 倩

山西大学生命科学学院，太原 030006

十六种晋产北柴胡柴胡皂苷含量分析

周 琼，郝建平*，高可青，关 倩

山西大学生命科学学院，太原 030006

本实验分别以高效液相色谱法和分光光度法测定了山西省十三个产地的16种北柴胡中柴胡皂苷a、d及柴胡总皂苷的含量。结果表明，在16种晋产北柴胡中，柴胡皂苷a的质量分数为0.038%～0.369%，柴胡皂苷d的质量分数为0.036%～0.681%，柴胡总皂苷的质量分数为0.354%～3.949%;12种晋产北柴胡中的柴胡皂苷a、10种中的柴胡皂苷d和13种中的柴胡总皂苷含量分别超过了0.1%、0.2%和1.0%。

北柴胡;柴胡皂苷;高效液相色谱法;分光光度法

北柴胡(Bupleurum chinense DC.)是伞形科柴胡属多年生草本植物，也是《中国药典》规定的柴胡正品药材的原植物［1］。柴胡以根入药，是常用大宗中药材。长期不合理的滥采乱挖导致野生北柴胡资源趋于枯竭，现在柴胡药材的供应以家种品为主。由于栽培类型种源混杂和种性退化，在北柴胡人工种植中普遍存在药材产量不高、质量均一性差和疗效稳定性不好等问题。北柴胡广泛分布于山西省的86个县市［2］，是山西省的道地药材。本实验对采自山西省十三个主要种植、分布县(市)的16种栽培和野生北柴胡的根进行了皂苷含量的测定与比较，旨在为北柴胡的种质选育提供参考依据。

1 仪器及试剂

1.1 材料来源

供试材料分别采集于山西省的长治市及万荣、夏县、稷山、和顺、左权、陵川、平定、盂县、交城、阳曲、定襄、右玉等十三个县。

1.2 实验仪器

高效液相色谱仪(美国Waters，Breeze色谱工作站，1525泵，2487紫外检测器)，Hypersil ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱(中国科学院大连化学物理研究所)，UNICO UV-2100紫外可见分光光度计，超声波细胞破碎仪等。

1.3 实验试剂

乙腈为色谱纯试剂(美国天地公司)，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。柴胡皂苷a和柴胡皂苷d对照品(纯度＞98.0%，上海中药标准化研究中心)。

2 实验方法

2.1 HPLC测定柴胡皂苷a和d的含量

2.1.1 色谱条件

色谱柱:Hypersil ODS-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);柱温:室温;UV检测波长:250 nm;流动相:乙腈-水(40∶60);流速:1.0 mL/min。

2.1.2 样品溶液的制备

将每个产地的北柴胡根烘干后称量0.5 g并研磨至粉末，用8%的氨水甲醇25 mL索氏提取1 h，提取3次;过滤蒸干，用甲醇定容至25 mL;取其中1 mL，加1 mL 8%的 HCl-CH3OH，30℃下反应24 h［3］;然后加入8%KOH-CH3OH中和，甲醇定容至5 mL。

2.1.3 柴胡皂苷a和d对照品溶液的配制

精确称取柴胡皂苷a对照品1.3 mg和柴胡皂苷d对照品1.1 mg，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解后定容，摇匀。

2.1.4 标准曲线的绘制

量取0.13 mg/mL柴胡皂苷a对照品溶液10、20、30、40、50、60、70和80 μL，分别置于5 mL容量瓶中，加8%的HCl-CH3OH溶液1 mL，30℃下反应24 h，再加8%KOH-CH3OH溶液1 mL，用甲醇定容，摇匀。分别取20 μL上述溶液注入色谱仪，按“2.1.1”项下的色谱条件测定峰面积。以峰面积值为纵坐标，柴胡皂苷a的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程:Y=26511X-3493.7，R2=0.9944。取柴胡皂苷d对照品溶液重复上述步骤，得回归方程Y=29527X-21843，R2=0.9946。

2.2 分光光度法测定柴胡总皂苷

2.2.1 样品溶液的制备

称取各样品粗粉0.5 g，置于50 mL锥形瓶中，加入25 mL 2%的KOH-CH3OH，用超声波细胞破碎仪处理30 min，冷却，摇匀。

2.2.2 标准曲线的绘制

量取1 mg/mL柴胡皂苷d的对照品溶液25、30、50、75、100、125和150 μL，水浴蒸发去溶媒后分别加入1%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1 mL，蒸干，加85%磷酸4 mL，70℃下加热30 min，冷却至室温，以蒸馏水为空白，以545 nm为检测波长，测定吸光度。以吸光度值为纵坐标，柴胡皂苷d的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程 Y= 32.8X-0.0005，R2=0.9966。

3 结果与分析

3.1 柴胡皂苷a和d的含量测定

3.1.1 精密度试验

分别量取1.3 mg/mL柴胡皂苷a对照品溶液和1.1 mg/mL柴胡皂苷d对照品溶液各20 μL，置于5 mL容量瓶中，加8%的HCl-CH3OH溶液1 mL， 30℃下反应24 h，再加8%KOH-CH3OH溶液1 mL，用甲醇定容，摇匀。取反应后柴胡皂苷混合标准溶液按照“2.1.1”色谱条件进行HPLC测定，重复五次，得到的柴胡皂苷a和d峰面积的RSD分别为1.95%和0.57%，结果表明精密度良好。标准品柴胡皂苷a和d的HPLC图谱如图1。

图1 标准品柴胡皂苷a和d的HPLC色谱图Fig.1 The HPLC chromatogram of saikosaponin a and saikosaponin d

图1中，峰值5.509为柴胡皂苷a标准品，峰值7.9339为柴胡皂苷d标准品。由图1可知，采用高效液相色谱法对晋产不同类型的北柴胡根中柴胡皂苷a和d的含量进行测定，目标峰清晰稳定，方法简便可行，可作为实验室测定柴胡皂苷a、d的方法［4］。

3.1.2 稳定性试验

随机取1号样品(见表1，下同)五份，按“2.1.2”制备样品溶液，在0、2、4、6、8 h时进行HPLC测定。柴胡皂苷a和d的测定结果的RSD分别为0.78%和1.46%，表明样品在8 h内稳定性良好。

3.1.3 重复性试验

随机取5号样品，精密称取五份，按照“2.1.2”项制备样品溶液，在“2.1.1”的条件下测定，柴胡皂苷a和 d的测定结果的 RSD分别为1.46%和0.97%，表明重复性良好。

3.1.4 回收率试验

称取已知含量的北柴胡细粉，加入1 mL的柴胡皂苷d的标准品，按照样品测定方法测定，计算出回收率的RSD为1.47%。

3.1.5 样品的测定

量取“2.1.2”制备的各样品溶液20 μL，过0.45 μm滤膜，注入色谱仪，按照“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积，计算其含量，结果见表1。

3.2 柴胡总皂苷含量测定

3.2.1 精密度试验

取柴胡皂苷d对照品溶液，以蒸馏水为空白，在545 nm处测定吸光度，连续测定五次，所得RSD为1.57%，表明精密度良好。

3.2.2 稳定性试验

分别称取1号、11号和14号样品，每隔10 min测定一次总皂苷，连续测量五次，并在24 h后重复进行测量，所得RSD均小于3%，表明样品在24 h内比较稳定。

3.2.3 重复性试验

随机取16号样品，精密称取五次，按照“2.1.1”项制备样品溶液，以蒸馏水为空白，在545 nm处测定吸光度，所得RSD为2.06%，表明重复性良好。

3.2.4 回收率试验

称取已知含量的北柴胡根细粉，加入1 mL的柴胡皂苷d的标准品，按照样品测定方法测定，计算出回收率的RSD为2.34%。

3.2.5 样品的测定

量取“2.1.1”项下的样品溶液10 mL，置蒸发皿中于水浴上蒸干，残渣加正丁醇饱和的水10 mL，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取三次，每次用量分别为20、10和10 mL，合并正丁醇层，置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶液溶解，定容至10 mL容量瓶中，摇匀。再移取此甲醇溶液0.5 mL，蒸去溶媒后加1%对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1 mL，蒸干，加85%磷酸4 mL，70℃下加热30 min，冷却至室温，以蒸馏水为空白，在545 nm处测定吸光度，测定结果如表1。

表1 晋产北柴胡样品中的柴胡皂苷含量Table 1 The content of each component in the samples ofB.chinensefrom Shanxi

按照柴胡皂苷a的质量分数不低于0.1%，柴胡皂苷d的质量分数不低于0.2%，柴胡总皂苷的质量分数不低于1.0%质量控制指标的要求［4-7］，在十三个产地的16种样品中，除了长治老顶山、交城、交城庞泉沟和定襄北柴胡外，其余12种中的柴胡皂苷a的质量分数均达到质量控制指标，其中以产自陵川六泉的北柴胡的含量最高，为0.369%;除了长治老顶山、平定、交城、交城庞泉沟、定襄和右玉北柴胡外，其余10种中的柴胡皂苷d的质量分数达到质量控制指标，其中以产自阳曲的北柴胡的含量最高，为0.681%;除了长治老顶山、交城、交城庞泉沟北柴胡外，其余13种中柴胡总皂苷的质量分数达到质量控制指标，其中以秋季夏县采集的含量最高，达3.949%。由表1也可以看出，在16种样品中，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d及柴胡总皂苷三者之间不存在正比关系，柴胡皂苷a或d含量的高低必然会影响到总皂苷的含量;柴胡皂苷a含量高的类型其柴胡皂苷d的含量不一定高，反之亦然［8］。因此，不宜单独用其中一种成分含量的高低来评价其质量的好坏，药材质量的评价标准应当考虑多方面的因素。

除了一种夏县北柴胡根采集自2010年10月外，其余15种样品均采集于2010年5～6月。采自陵川县六泉乡、左权县、长治老顶山、定襄县、和顺县和交城庞泉沟的6个类型为野生类型，其余10种均为两年生栽培型。六种野生北柴胡根的生长年份难以准确确定，但其直径均与10种栽培类型基本相当。测定结果反映了各类型北柴胡根中皂苷的相对含量以及基因型的差异，可以作为优良类型人工驯化、种植乃至种质培育的参考指标。

表2 晋产北柴胡生态环境Table 2 Environments ofB.chinensefrom Shanxi

表2为各晋产北柴胡产地的生态环境，表中数据来自当地气象资料。综合表1和表2结果，以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d及柴胡总皂苷的绝对含量以及北柴胡喜稍冷晾且湿润的气候与耐寒、耐旱、忌高温、忌涝洼积水特点为依据［9］，参考“北柴胡适生地分析及数值区划研究”［2］的结果，可以得出如下结论:适合晋产北柴胡生长的地区一般地理及气候条件为:海拔1200～1400 m，气候以暖温带大陆性季风气候为主，年平均降水量在450 mm左右。

1 Pharmacopoeia editorial committee of the ministry of health.Chinese Pharmacopoeia(First).Beijing:People's Health Publishing house，2005，198.

2 Chen SL(陈士林)，Xiao PG(肖培根).Introduction to the Sustainable Utilization of Chinese Herbal Medicine Resources.Beijing:China Medical Science and Technology Publishing House，2006.

3 Li YY(李媛媛)，Qin XM(秦雪梅)，Wang YQ(王玉庆)，et al.Determination of content of saikoside inBupleurum chinensefrom different sources.China J Chin Mater Med(中国中药杂志)，2008，33:237-239.

4 Bai XM(白雪梅)，Tian JM(田嘉铭)，Wang DB(王德宝).HPLC determination of different origin saikosaponin a and d levels.Chin Tradit Patent Med(中成药)，2006，28:440-441.

5 Zhang D(张岱).Compare of the content of total saponin inBupleurumfrom different sources.Tianjin Pharm(天津药学)，2001，13:60.

6 Li YY(李媛媛)，Qin XM(秦雪梅)，Wang YQ(王玉庆)，et al.Association of differentBupleurum chinenseDC.cultivars with contents of active components.J Shanxi Coll Tradit Chin Med(山西中医学院学报)，2007，8:44.

7 Kong LL(孔伶俐)，Cui QJ(崔青娟)，Shi DS(史德胜)，et al.HPLC determination of saikosaponin content of saikosaponin a.Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，2004，35:643-644.

8 Wang P(王鹏)，Jia LY(贾凌云)，Sun QS(孙启时)，et al.Determination of the content of saikoside inBupleurum chinenseDC.from different sources.J Shenyang Pharm Univ(沈阳药科大学学报)，2004，21:193-195.

9 Wang YP(王英平).The Key of Raise Seedlings Technologies.Beijing:China Agriculture Press(中国农业出版社)，2005.

Analysis on Saikosaponin of Sixteen Bupleurum chinense from Shanxi

ZHOU Qiong，HAO Jian-ping*，GAO Ke-qing，GUAN Qian
School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China

Saikosaponins a and d were used as the chemical reference substance to establish HPLC and visible-spectrophotometry methods for determination of total contents of saikosaponin in sixteen kinds ofBupleurum chinensefrom thirteen production areas in Shanxi province.The results showed that the contents of saikosaponins a and d and the total saikosaponin inB.chinensewere 0.038% ～0.369%，0.036%～0.681%，and 0.354% ～3.949%，respectively.In addition，the contents of saikosaponin a in 12 species，saikosaponin d in 10 species，and the total saikosaponin in 13 species were more than 0.1%，0.2%and 1.0%，respectively.

Bupleurum chinenseDC.;saikosaponin;HPLC;visible-spectrophotometry

Q284.2

A

1001-6880(2012)05-0644-04

2011-04-14 接受日期:2011-08-31

山西省科技攻关计划项目(20100311091)

*通讯作者 Tel:86-013935168866;E-mail:jphao@sxu.edu.cn