雷公藤甲素促进人鼻咽癌CNE-1细胞凋亡及机制

闫燕艳，范利国，白建平，杨 霞，李红霞

（山西大同大学医学院，山西大同 037009）

雷公藤甲素促进人鼻咽癌CNE-1细胞凋亡及机制

闫燕艳，范利国，白建平，杨 霞，李红霞

（山西大同大学医学院，山西大同 037009）

目的 探讨雷公藤甲素促进人类鼻咽癌CNE-1细胞凋亡的机制。方法MTT法检测雷公藤甲素对CNE-1的细胞毒作用；Hoechst 33258染色荧光显微镜观察细胞凋亡形态学改变；Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白的变化。结果雷公藤甲素对CNE-1有强大的细胞毒作用，IC50为0.029±0.007μmoL/L；该化合物可浓度依赖性地诱导CNE-1细胞发生凋亡，出现典型的凋亡小体及细胞凋亡相关蛋白Caspase-3的裂解活化。结论雷公藤甲素可浓度依赖性地诱导人鼻咽癌CNE-1细胞发生凋亡，且与Caspase-3的裂解活化有关。

雷公藤甲素；细胞凋亡；鼻咽癌；CNE-1

雷公藤甲素（Triptolide，TPL），是从中药雷公藤中提取的环氧化二帖内酯化合物，见图1，具有多种生物活性，并且其抗癌作用强于雷公藤红素和扁塑藤素，阐明抗癌分子作用机制对于雷公藤今后在临床上合理的使用具有重要的意义。本研究主要探讨TPL诱导人鼻咽癌CNE-1细胞凋亡及作用机制。

图1 雷公藤甲素（Triptolide，TPL）的结构

1 材料与方法

1.1 细胞株与细胞培养

人鼻咽癌CNE-1细胞株为中山大学肿瘤防治中心提供，用含有10％的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养液。细胞在37℃和5％CO2的实验条件下培养。大多数实验均在细胞处于对数生长期进行。

1.2 药品、主要试剂

TPL购自广州牌牌生物科技有限公司，纯度大于98％，将其溶于DMSO配成1 mmol/L的母液，临用前用含有10％的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养液稀释至所需浓度。RPMI 1640培养基及胎牛血清购自GIBCO公司，Caspase-3抗体及增强 PhototopeTMHRP化学发光试剂盒购自 Cell Signaling公司，GAPDH抗体及二抗IgG-HRP购自上海康成生物公司，MTT及 Hochest 33258购自 Sigma公司，Prestained Protein Marker购自 Fermentas公司，PVDF膜购自Milipore公司。其他常用试剂均购自广州威佳科技有限公司。

1.3 MTT法检测细胞毒实验

取对数生长期CNE-1细胞分别以1.5×104/mL的浓度接种于96孔培养板，每孔体积为190μL。培养24 h待细胞贴壁后，分别加入10μL不同浓度的TPL，同时设空白对照组和 DMSO溶剂对照组，每组设4个平行孔。培养68 h后加入5 mg/mL的MTT 20μL，继续培养4 h，弃去培养液，每孔加入100μLDMSO，待完全溶解显色后，用酶标仪540/655 nm双波长测定，以Bliss法计算细胞生长被抑制50％时的药物浓度，即 IC50值[1]。 按下式计算细胞存活率，细胞存活率=实验组平均 OD值/对照组平均OD值×100％。

1.4 Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态

取对数生长期CNE-1细胞接种于6孔板中，过夜培养贴壁后分别加入浓度为0.02，0.04，0.08 μmoL/L TPL作用24 h后收集所有细胞，用冰PBS洗2次，离心1 000 r/min×5 min，弃上清。以4％多聚甲醛1 mL固定20 min后，PBS洗1次，离心1 000 r/min×5 min，弃上清，加入1 mL Hoechst 33258染色液（终浓度为 10μmol/L），37℃避光孵育30 min，PBS洗3次，90％的甘油封片，荧光显微镜下 （×400）随机观察N个视野并拍照[2]。

1.5 Western Blot检测蛋白的表达

经0.02，0.04，0.08μmoL/L TPL作用CNE-1细胞24 h后，收集所有细胞提取蛋白，并对蛋白定量[3]。在8％～12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，每孔加入50～100μg蛋白样品，80～180 V电泳分离蛋白；80 V转印2～3 h至PVDF膜上；5％脱脂奶粉（以TBST缓冲液溶解）室温封闭2 h；特异性一抗 （1∶1 000）封闭4℃过夜，TBST洗3次，每次10 min；二抗IgG-HRP （1∶5 000）反应2 h；TBST洗3次，每次10min；经增强PhototopeTMHRP化学发光试剂反应约30 s，暗室压片，自动X光胶片机冲洗胶片。

2 结果

2.1 TPL对人鼻咽癌CNE-1细胞有强大的细胞

毒作用

体外MTT实验表明，TPL对人鼻咽癌CNE-1细胞表现出强大的细胞毒作用，IC50值为0.029± 0.007μmoL/L，见图2，提示该化合物可能具有潜在的抗鼻咽癌的作用。

图2 MTT检测TPL对CNE-1的细胞毒作用

2.2 TPL浓度依赖性地诱导CNE-1细胞发生凋亡

Hoechst 33258是一种特异性DNA荧光染料，可以嵌合于DNA链的A-T区，受到波长200～380 nm的紫光激发，可释放波长420 nm的蓝色荧光。经0.02，0.04，0.08μmoL/L TPL分别作用CNE-1细胞24 h后，细胞出现凋亡的典型变化—凋亡小体，细胞核固缩、边集，有的断裂成大小不一的圆形颗粒，呈现亮蓝色浓染的块状或颗粒状荧光，而对照组细胞核形规则，呈弥散均匀的淡蓝色荧光，见图3。

图3 Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态学改变

2.3 TPL诱导CNE-1凋亡与Caspase-3裂

解活化有关

Caspase-3的裂解活化是反应凋亡的经典指标[4]。当用0.02，0.04，0.08μmoL/L TPL分别作用CNE-1细胞 24 h后，Western blot结果显示Caspase-3出现了明显的裂解活化，即 35KD Procaspase-3浓度依赖性降低，见图4。上述实验结果进一步表明，TPL能够浓度依赖性地诱人鼻咽癌CNE-1细胞发生凋亡，且与Caspase-3的裂解活化有关。

图4 Western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3的改变

3 讨论

鼻咽癌是我国华南地区极其高发的恶性肿瘤之一，又被称为“广东瘤”（Canton tumor），据WHO粗略估算，世界上80％的鼻咽癌发生在我国。鼻咽癌的发生发展涉及到遗传易感性、EB病毒及环境等多种因素，以放疗为主的综合治疗是主要治疗手段。中药治疗也是综合治疗NPC的一种有效手段。中药可配合放化疗，减轻放化疗副作用，扶正固本；个别晚期病例已不能做放化疗也可考虑单独中药对症治疗。

从中药中筛选抗肿瘤药物是目前肿瘤药物治疗研究的一个热点[5]。雷公藤甲素是雷公藤发挥抗肿瘤作用的主要活性物质。近年来大量体内外研究表明TPL对多种癌症，如白血病、乳腺癌、胰腺癌及肺癌等均有良好的抗肿瘤活性[6-8]。最近的研究发现TPL除了特异地影响某些蛋白和信号通路外，还会抑制广泛的基因转录，上海药物研究所俞强课题组对TPL抑制广泛基因转录的分子机制进行了深入研究[9]。目前TPL在美国做Ⅰ期临床。我们的研究发现，TPL对人鼻咽癌CNE-1细胞有强大的细胞毒作用，IC50为0.029±0.007μmoL/L，提示该化合物可能具有潜在的抗鼻咽癌作用。本文重点探讨TPL促进人人鼻咽癌CNE-1细胞凋亡的机制，这将为鼻咽癌的治疗提供新的实验依据。

Caspases家族成员在介导细胞凋亡的过程中扮演着重要的角色[10]，根据其在凋亡级联反应中对底物的特异性及靶点蛋白的不同，将Caspases家族成员分为两类：凋亡启动子和凋亡执行子，前者包括Caspase-2，-8，-9，-10，后者包括Caspase-3，-6，-7[11]。在正常细胞内，每一种Caspase都以无活性的酶原形式存在。在死亡信号及凋亡刺激的作用下，Procaspase通过自我切割成为活性Caspase，继而又激活家族中其他成员，引起蛋白酶解的级联反应。最后，被激活的Caspase切割并与细胞凋亡相关的关键蛋白从而引起细胞凋亡。我们的研究表明，经0.02，0.04，0.08μmoL/L TPL分别作用CNE-1细胞24 h后，Hoechst 33258染色荧光显微镜下观察，CNE-1细胞对照组细胞核形规则，呈弥散均匀的蓝色荧光，加TPL处理组呈现浓度依赖性的细胞凋亡特征，细胞核固缩、边集，有的断裂成大小不一的圆形颗粒，呈现高亮蓝色浓染的块状或颗粒状荧光，这些结果表明TPL导致CNE-1细胞发生凋亡形态学改变；Western Blot方法进一步检测到凋亡经典指标Caspase-3的裂解活化。以上结果确证了 TPL能浓度依赖性地诱人鼻咽癌CNE-1细胞发生凋亡，且与Caspase-3的裂解活化有关。

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Triptolide Induced Cell Apoptosis in N asopharyngeal C arcinoma CNE-1 Cells

YAN Yan-yan，FAN Li-guo，BAIJian-ping，YANG Xia，LIHong-xia
（School ofMedicine，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009）

Objective To investigate triptolide induced cell apoptosis in nasopharyngeal carcinoma （NPC）CNE-1cells.Methods The cytotoxicity of Triptolide to CNE-1 cells wasmeasured by MTT assay；Apoptotic morphology was observed after Hoechst 33258 staining；Changes of apoptotic related proteins were analyzed by western blot.Results Triptolide exhibited potent cytotoxicity against NPC CNE-1 Cells，and IC50 was 0.029±0.007μmoL.L-1.After CNE-1 cells were treated with different concentrations of triptolide for 24 h，typical apoptotic bodies and activation of Caspase-3 were detected in a dose-dependentmanner.Conclusion Triptolide induced CNE-1 cancer cells apoptosis in a dose-dependentmanner，which correlation with caspase-3 activation.

Triptolide（TPL）；a poptosis；Nasopharyngeal carcinoma（NPC）；CNE-1〔责任编辑 杨德兵〕

R739.63

A

1674-0874（2012）03-0045-04

2012-03-15

山西大同大学博士科研启动项目[2010-16-1]

闫燕艳（1981-），女，山西平定人，博士，讲师，研究方向：肿瘤药理学。