复方甘草酸苷对大鼠急性肝衰竭保护机制的研究

裴旭东，翟玉峰，张怀宏

复方甘草酸苷对大鼠急性肝衰竭保护机制的研究

裴旭东，翟玉峰，张怀宏

目的 探讨甘草酸苷对大鼠急性肝衰竭(AHF)的保护机制。方法 将90只Wistar大鼠随机分为3组:正常对照组(对照组)、模型组(AHF组)、治疗组(甘草酸苷组)，静脉注射硫代乙酰胺(TAA)600 mg/kg，2次，每次间隔24 h，复制AHF动物模型。治疗组动物除予TAA外，于实验前3 d至实验结束分别静滴甘草酸苷注射液2 mL/100 g，对照组和AHF组同时皮下注射0.9%氯化钠液1 mL/100 g。AHF组、治疗组于第2次注射TAA后24 h，随机各取8只，治疗中分时段取大鼠腹主动脉血检测肝功能、PTA、血清内毒素及多种炎性因子水平。2周后，取肝组织，用10%甲醛液固定，检测肝细胞增殖细胞核抗原阳性率(PCNA)。结果 与AHF组、对照组相比，治疗中，治疗组血清ALT水平降低(P＜0.01);治疗2周后，治疗组血清总胆红素水平(同比例)降低，而血浆凝血酶原活动度(PTA)均值较高(P＜0.01);治疗后各时相点，治疗组TNF-α水平较低(P＜0.01);治疗2周后，治疗组患者血浆内毒素及IL-6水平显著降低(P＜0.01)。治疗2周后，治疗组PCNA阳性细胞表达显著高于对照组(P＜0.01)。结论 甘草酸苷对急性肝衰竭大鼠模型具有保护作用，其机制可能与降低血浆内毒素及细胞因子水平、促进肝组织PCNA表达有关。

急性肝衰竭;内毒素;细胞因子;增殖细胞核抗原;甘草酸苷

Key words:Acute hepatic failure;Endotoxin;Cytokine;Proliferation cell nuclear antigen;Compound glycyrrhizin

急性肝衰竭(AHF)表现为肝细胞广泛坏死和肝功能严重障碍，临床上死亡率极高，目前尚无有效的治疗方法。其病理与细胞免疫导致的炎性坏死有关，其中以肿瘤坏死因子-α(TNF-α)为核心的细胞因子网络在肝细胞坏死或凋亡中具有重要作用［1-2］。有研究显示，复方甘草酸苷(Compound glycyrrhizin，CG)能有效降低暴发性肝衰竭大鼠模型血浆TNF-α、NO、内皮素(ET)、白细胞介素-6 (IL-6)水平，对肝损伤产生保护作用［3］。本文建立大鼠AHF模型，深入探讨两者联合使用对AHF细胞再生作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级Wistar大鼠，体质量180～230 g，雌雄各半，购自武汉大学医学动物中心。硫代乙酰胺(TAA)，北京中杉生物科技有限公司生产。PCNA试剂盒，购自武汉博士德公司。SNMC注射液为复方甘草酸苷(美能)日本米诺发源制药株式会社生产提供。促肝细胞生长素(HGPF)，购自威海赛洛金药业有限公司。

1.2 试验方法 90只大鼠随机分为3组:正常对照组(对照组)12只，模型组(AHF组)12只，治疗组12只。实验开始，AHF组、治疗组采用皮下注射(sc.)TAA 600 mg/kg，2次，间隔24 h，复制AHF动物模型。治疗组除给予TAA外，于实验前3 d至实验结束给予 CG注射液 1 mL/100 g (sc.)，AHF组同时予0.85%氯化钠注射液1 mL/ 100 g(sc.)。AHF组、治疗组于第2次注射TAA后24 h，随机取大鼠各8只，麻醉后腹主动脉取血测肝功能。随后迅速取肝左中叶组织，用10%甲醛液固定，石蜡切片，备检。其余大鼠用于2周病死率观察。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 肝功能 丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TBiL)及血浆凝血酶原活动度(PTA)水平，全自动生化分析仪测定。

1.3.2 血浆内毒素检测采用鲎试验(试剂为武汉博士德科技有限公司产品)，TNF-α和IL-6检测采用ELISA法(试剂为上海罗氏生物制药有限公司产品)。

1.3.3 肝细胞增殖细胞核抗原(PCNA) 石蜡切片经脱蜡水化后，以磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，加10%正常羊血清封闭，顺序加一抗、二抗、三抗，继之以PBS冲洗，以联苯二氧胺(DBA)显色，甲基绿复染。胞核显示棕褐色为PCNA阳性。PCNA标记指数以随机选择高倍视野中至少500个细胞，以计数PCNA阳性核百分数表示(阳性核数目/计数的肝细胞总数×100%)。

2 结果

2.1 各组病死率比较 AHF组、对照组、治疗组2周病死率分别为68.2%(7/12)、16.7%(2/12)、25.0%(3/12)，治疗组与 AHF组比较，P＜0.01);与对照组比较，P＞0.05。

2.2 各组肝功能情况比较 见表1。由表1可见，治疗前，三组患者血清ALT、TBiL及PTA比较，差异无统计学意义(P＞0.05);治疗后，治疗组各时相点治疗组血清ALT水平显著低于AHF组(P＜0.01);对照组各时相点治疗组血清ALT水平低于AHF组(P＜0.05);治疗2周后，治疗组血清TBIL水平显著低于AHF组，PTA均值明显高于AHF组(P＜0.01);而对照组血清TBIL水平低于AHF组(P＜0.01)，PTA均值高于AHF组(P＜0.05);

表1 各组肝功能情况比较

2.3 各组患者血浆内毒素水平及细胞因子水平的变化 见表2。治疗前，三组患者血浆内毒素及细胞因子水平比较，差异无统计学意义(P＞0.05);治疗后1、2周后，治疗组患者血浆内毒素、IL-6水平显著低于AHF组、对照组(P＜0.01);治疗后各时相点，治疗组TNF-α水平低于AHF组、AHF组及对照组(P＜0.01)。

表2 各组患者血浆内毒素水平及细胞因子水平的变化

2.4 各组治疗后各时相PCNA阳性细胞表达率检测比较 见表3。治疗后第1周，PCNA阳性细胞表达率明显高于AHF组(P＜0.01);治疗第2周，PCNA阳性细胞表达率与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。

表3 各组PCNA检测比较(%)

3 讨论

PCNA(周期蛋白，cyclin)，直接参与细胞增殖的DNA复制，其表达增高可促进细胞DNA合成增加［4］，起调节DNA多聚酶δ活性的作用。因此，检测PCNA在细胞中的表达，可评价细胞的增殖状态［5］，是评价肝脏再生的一个良好指标。PCNA在正常肝细胞中表达的阳性率很低，随着肝细胞增生活跃，尤其是肝切除后，阳性率逐渐增加，说明细胞的增殖能力逐渐增强。Wolf采用PCNA与5-溴脱氧尿核苷检测DNA合成，发现与肝脏再生有正相关性［2］。

甘草酸苷(CG)主要活性成分β体甘草酸为2分子萄萄糖醛酸和苷元-甘草次酸的聚合物，在体内经β-葡糖醛酸苷酶将二者分解。甘草次酸在化学结构上类似肾上腺皮质激素，而后者在肝内代谢失活起竞争性抑制作用，间接提高了体内皮质激素的水平。本研究表明，甘草酸苷可从多个环节对AHF产生保护作用:①抗炎保肝作用，能促进肝细胞修复［6-7］;②抑制TNF-α、IL-6等细胞因子的产生，减轻内毒素介导的继发性肝细胞损伤;③促进重型肝炎患者血浆内毒素的清除;④降低胆红素及透明质酸含量，有促进氧化磷酸化、活跃肝细胞生物氧化功能和蛋白质合成作用，阻断AHF病变的发展。日本学者已证实，CG具有抗小鼠FLF细胞凋亡作用［1］，对AHF大鼠肝细胞有保护机制。本研究表明，CG不仅具有护肝、降酶、退黄作用，而且可以减少AHF的肝细胞凋亡，使AHF中变性的肝细胞恢复，使未受到损伤的肝细胞得到保护，促进肝细胞的再生，从而使AHF的肝细胞坏死面积缩小，降低大鼠的病死率［8］。

综上所述，CG可以清除内毒素，降低炎性介质水平，促进PCNA表达水平，减少肝细胞凋亡，从而促进肝细胞的再生，从而使AHF的肝细胞坏死面积缩小，降低病死率。但CG治疗AHF的剂量和治疗时机尚无明确定论，本实验所用小剂量相当于临床上应用的一般剂量。至于大剂量是否有毒副作用还有待于进一步探讨。

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Efficacy of protective mechanism of compound glycyrrhizin on acute hepatic fail-urein rats

PEI Xu-dong，ZHAI Yu-feng，ZHANG Huai-hong(Henan Province Nanyang Urban Central Hospital，Nanyang 473009，China)

Objective To study the protective mechanism of compound glycyrrhizin(CG)on acute hepatic failure(AHF)in rats.Methods 90 rats were randomly divided into normal group，model group and treatment group (compound glycyrrhizin).Thioacetamide(TAA)600 mg/kg was given(iv.)once daily for 2 times，and model of AHF was made.Treatment group was given CG 2 mL/100 g(iv.)at 3 d before and after treatment besides TAA，while control group and AHF group were given NS 1 mL/100 g(ih.).The ALT，TBIL，PTA，endotoxin and many kinds of inflammatory factor level were measured.The hepatic tissue was taken and fixed into 10%formalin after 2 weeks，and the masccline rate of proliferation cell nuclear antigen was detected.Results Compared with AHF group and control group，serum ALT levels in treatment group were significantly lower(P＜0.01);The average level of serum total bilirubin(TBIL)in treatment group was lower，and the average level of serum plasma prothrombin activity (PTA)was higher after 2 weeks(P＜0.01);The level of TNF-a in treatment group was lower during treatment(P＜0.01).The levels of plasma endotoxin and interleukin-6 in treatment group were significantly lower after 2 weeks(P＜0.01).The masccline rate of proliferation cell nuclear antigen in treatment group was higher than those of control group after 2 weeks(P＜0.01).Conclusion CG can protect AHL of rat model，and the mechanism could be concerned with decreasing levels of endotoxin and cytokine，promoting express of proliferation cell nuclear antigen.

2011－11－04

河南省南阳市中心医院，河南南阳473009