实时荧光定量PCR仪原理与技术关键点分析

郑沁春 福建省立医院设备科 （福州 350001）

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种在体外模拟体内DNA复制的核酸扩增技术，以少量的DNA分子为模板，经过变性-退火-延伸的多次循环，以接近指数扩增的形式产生大量的目标DNA分子[1]。由Mullis在1983年建立的PCR方法已成为分子生物学及其相关领域的经典实验方法[2]。能够提供PCR反应条件，自动完成PCR反应的仪器就叫做PCR仪[3]。近年来，该技术本身获得长足发展，可靠性不断提高，其中以实时荧光定量PCR技术的方法应用最为广泛，已成为分子生物学研究的基本技术平台，通过此技术平台开展的基因表达分析、基因检测、SNP（单核苷酸多态性）基因分型、基因突变扫描、染色体易位分析病毒载量分析、MicroRNA表达分析和CHIP等多种研究已取得了众多成果，得到了国际相关领域专业人士的认可[4]。

1.实时荧光定量PCR原理

图1. Ct值与起始模板浓度的关系

所谓实时荧光定量PCR技术（Real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[5]。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成3个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化[6]。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。

为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR 技术中有个非常重要的计算工具：Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数[7]。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系[8]，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如图1所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

2.实时荧光定量PCR仪的工作部件及工作测量原理

荧光定量PCR系统由热循环系统、激发光源及检测部件组成。由于热循环系统控制着DNA的解链延伸，因此是荧光定量PCR仪最为关键的技术部位，目前实验室常用的PCR 仪按热循环系统大致可分为水浴式、气流式和半导体式3种[9]。其中应用最广的是半导体式PCR 仪，其热循环系统结构如图2所示。半导体制冷片均匀地串联平铺，用以加热制冷，其上方为一带96 孔的金属块基座，为保证基座各孔的温度均匀，其下方紧贴一块散热片并安装风扇。通常在制冷片与基座和散热片之间的接触面上均匀涂抹一层薄的导热胶，以减小热阻[10]。

2.1 PCR仪热循环系统的硬件研究与设计

图2. 半导体PCR仪热循环系统示意图

PCR加热系统有几种方案，他们的输出波形如图3所示。图3(a)为交流输出调相调压(或移相调压)方案。需要双向晶闸管，移相触发电路等环节。单片机控制双向晶闸管的导通角，从而改变输出到加热丝的交流电压有效值大小，达到改变加热功率的目的。如图中T2阶段的交流有效电压U2比T1的U1大。图3(b)是在图3(a)的电路基础上，增加整流和滤波环节得到可调直流输出的大小。图3(c)是将交流电全波整流输出，输出为脉动流，调整其幅度，从而调整其平均直流输出的大小。这3种方案，单从加热角度看是没有问题的，但从升降温时控制响应速度和对生化反应的电磁脉冲干扰角度考虑，都存在一定的问题。

图3. 四种功率输出驱动电路输出波形比较

图4.方案(d) 的原理示意图

图5. 3种控温算法

图3(d)方案的电路如图4所示。单片机通过INT0感知交流电的零点，由PL0输出控制信号，并经过零信号同步输入给OC门75452，75452控制固态继电器来调节输出给加热丝的交流电周波个数。最大输出周波个数为50Tc。例如，控制周期为Tc=10s，则在一个控制周期内，零码输出零个周波(无)，半码输出250个周波，全码输出500(50×10)个周波等等。而且是整周波输出(零点导通，零点截止)，不会是畸形的非整周期非正弦波形输出。输出可在0到500(50Tc)个周波之间调整，如图3(d)所示，该方案电路简单， 时间响应快，零点触发无干扰。在软件配合下，可以完成预定设计任务。

2.2 PCR仪温度控制算法

PCR仪除了合理设计硬件电路之外，还需要在软件算法上仔细研究、合理设计才能很好地完成PCR 的控温任务，一般的PID控制效果如图5中曲线1所示。由于积分饱和作用，使得控制结果具有很大的超调，而且上升沿也不迅速。图5中曲线2 所示为采用积分分离算法的控制效果。该算法是在未进入±∈的误差限制范围(误差带)内不进行积分，进入±∈的误差带内才开始积分。虽然没有超调，但是上升沿速度太慢，以上两种算法都存在两个方面的问题：一是PID的整定参数不能随情况的变化而变化(不具有参数自整定功能)；二是它们均将风扇的速度恒定不变，而仅仅去改变加热器产生的热量。属于单参数控制，不能得到双参数联合控制的效果。图5曲线3所示为采用分段积分变风速双参数控温算法，考虑同时使用调节加热量和改变风扇风速的策略，并具有参数自整定功能。

3.激发及检测部件的质量控制及测量

荧光定量PCR仪都是使用荧光化学检测法[11]，可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：

3.1 TaqMan荧光探针

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团[12]。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

3.2 SYBR荧光染料

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

4.影响荧光定量PCR仪高精密的其他因素

操作规范影响着测量结果，特别是在DNA抽提的时候，如果DNA被污染或者降解将会显著影响检测结果。其次引物设计也尤为关键，虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算最合适的退火温度，可是由于模版中碱基的组合千变万化，对于特殊片断，经验公式得到的数据不一定能“P”出来结果，细微的变化对结果都可能产生决定性的影响，因而反复“摸条件”对测量结果显得尤为重要。在实验反应过程中，试剂的使用也是极为关键的步骤，对于多种聚合酶混合酶扩增如Invitrogen、Clontech、Promega的多数高保真Taq酶来说这个非常重要[13]，因为Taq和校正酶的最佳反应温度可能有显著差异。

5.小结

由以上介绍，我们可以知道实时荧光定量PCR的出现克服了传统PCR技术普遍存在的假阳性及不能定量等问题，使得PCR技术更广泛地应用于临床及其药物方面，目前已经在肿瘤研究、乙肝诊断、病毒检测、动物疾病检测与防御、药物疗效的评价与考核等方面，为临床理论研究、治疗疾病和药物开发提供了客观的物质基础。实时荧光定量PCR具有范围宽、敏感性高、精确度高和无PCR后处理步骤，避免了交叉污染，产出率高，可以进行多重检测的优点，使得其在基础研究和分子诊断领域受到青睐，成为当今研究mRNA表达水平最热门的技术之一，是迄今为止定量最准确、重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，其应用领域将越来越广泛。

[1]曹雪雁，张晓东，樊春梅，等.聚合酶链式反应（PCR）技术研究新进展[J].自然科学进展，2007，17（5）：580．

[2]陶生策，张治平，张先恩，等.PCR技术研究进展[J].生物工程进展，2001,21（4）：26．

[3]赵琦，李宾，周慧，等.PCR技术的新进展[J].生命的化学，2002，22（3）：288-289．

[4]陈茹，孙洋，刘军，郭学军，等.荧光实时定量PCR方法检测猪链球菌2型[J]. 中国兽医学报，2008（1）：5～7．

[5]王梁燕，洪其华，等.实时定量PCR技术及其应用[J].细胞生物学杂志.2004（2）：62～67．

[6]阳成波，蒋原，等.基于TaqMan探针的RealtimePCR定量检测空肠弯曲杆菌[J]. 动物医学进展，2003(1):74～78．

[7]刘圆圆，肖性龙，吴晖，等.高致病性猪繁殖与呼吸系统综合症病毒荧光定量PCR检测方法的建立[J].现代食品科技，2008(7):731～734．

[8]刘世国，秦川，姚志军，等.弓形虫感染家兔血液中虫体的动态观察[J]. 中国人兽共患病学报，2006(2):759～760．

[9]陈启卷，周荣迁，等．一种新型的PCR仪［J］．工业仪表与自动化装置， 1999( 50): 54-56．

[10]韩彩霞，赵德明，吴长德，等. 用实时荧光定量RT-PCR检测方法定量绵羊Prp基因的表达[J].中国农业大学学报，2006(2):61～64．

[11]朱海，杨泽，李小燕，等.生果、蔬菜中大肠杆菌O157:H7荧光定量PCR检测方法的评估与改进[J]. 现代预防医学，2006(8):1473～1439.

[12]张明辉，敖金霞，曲波，等.大豆深加工产品两种荧光定量PCR检测方法的比较研究[J].生物技术，2006(2):56．

[13]徐淑菲， 孔繁德， 高隆英， 等. SYBRGreen I实时荧光PCR检测传染性鲑鱼贫血病[J].检验检疫科学，2007(5):27～31.