Poly I:C刺激下原发性干燥综合征患者单核细胞分泌Ⅰ型干扰素能力增强①

孙 懿 胡志德 谷明莉 黄元兰 薛 苗 郭方宇 邓安梅

(第二军医大学长海医院实验诊断科，上海200433)

干燥综合征(Sjögren Syndrome，SS)是一种主要发生于中老年女性的自身免疫性疾病，受累的器官主要是唾液腺和泪腺，长期的自身免疫性反应导致唾液腺和汗腺功能逐渐丧失，患者因而表现出口干、眼干等症状［1］。SS可以是原发性疾病(原发性干燥综合征，pSS)，也可以继发于其它自身免疫性疾病(继发性干燥综合征，sSS)。

以往的研究表明，Ⅰ型干扰素通路过度活化是SS发病机制的重要环节［2，3］。外周血高水平的Ⅰ型干扰素增强了SS患者淋巴细胞和腺体组织内多个干扰素诱导基因的表达，促进了自身免疫反应的发展［4-6］。长期以来，临床免疫学家对SS外周血高水平Ⅰ型干扰素的来源进行了大量深入的研究，发现病毒感染可能是引起外周血Ⅰ型干扰素水平增高的原因之一［7］。当病毒入侵机体时，位于抗原递呈细胞表面的模式识别受体(PRR)，如 TLR家族的TLR3、TLR7/8和TLR9以及RLR家族的 RIG-Ⅰ和MD5等，组成了机体对抗病毒感染的第一道防线。这些PRR在感知到病毒后，通过极为复杂且精细的信号转导途径，启动宿主的抗原递呈细胞内Ⅰ型干扰素的表达和释放，促进病原体的清除［8］。Ⅰ型干扰素是把“双刃剑”，虽然适度的、及时的Ⅰ型干扰素反应有助于病毒的清除，但是过度的、持续的Ⅰ型干扰素反应则会导致组织的慢性损伤，引发自身免疫性疾病［9］。值得注意的是，并非所有的病毒感染患者最终都会发展成SS，这表明在pSS发生与发展的过程中，除了病毒感染这一“外因”以外，机体免疫系统的固有个体特性这一“内因”还发挥着不可忽视的作用。

外周血单核细胞是Ⅰ型干扰素的重要来源，因此我们提出如下假说:pSS患者的单核细胞与健康个体单核细胞在分泌Ⅰ型干扰素的能力上可能存在差异，而这种差异可能是导致pSS发生或发展的重要因素。在本研究中，我们以Poly I:C刺激pSS患者和健康个体的单核细胞，观察其释放Ⅰ型干扰素的能力是否存在差异。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2010年2月至2011年8月期间第二军医大学长海医院和长征医院风湿科收治的新诊断的pSS患者14例，其诊断符合2002年美国-欧洲联合制定的干燥综合征诊疗指南［10］，所有pSS患者均无恶性肿瘤以及血液系统疾病，且最近一月以内无感染性疾病病史。pSS患者男女比例为2/12，年龄为(49.1±11.2)岁。另从同期来我院进行体检的个体中选取14名作为健康对照，健康对照组男女比例为2∶12，平均年龄为(45.9±13.5)岁。本研究经长海医院及长征医院医学伦理学委员会批准，所有受试对象均签署知情同意书。

1.2 细胞的分离与培养 于患者和健康对照治疗前采集空腹静脉血10 ml，2 000 r/min离心10分钟，收集上层血浆至-80℃保存备用。采用密度梯度离心法(淋巴细胞分离液LymphoprepTM购自挪威AXIS-SHIELD公司)分离出SS患者和健康对照者的外周血单个核细胞(PBMC)。之后采用磁珠分选法从部分PBMC中分离出CD14+的单核细胞，磁珠分离试剂盒购自美国Miltenyi biotec公司，分选过程按照生产商提供的操作说明进行。对于分选得到的CD14+的单核细胞，经流式细胞术鉴定纯度在90%以上时才进行下一步实验。所有分离得到的CD14+的单核细胞(阳性选择)、去CD14+单核细胞的PBMC(阴性选择)以及未经分离的PBMC均冻存于液氮中，待细胞收集完成后统一复苏培养，进行下一步实验。

待细胞复苏完成后，调整细胞浓度至2×105ml-1，以含10%胎牛血清或患者/健康对照血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基置于96孔板中37℃，5%CO2培养24小时后，同时加入终浓度不等的Poly I:C(购自Sigma公司)对细胞(包括PBMC，去除了单核细胞的PBMC以及CD14+单核细胞)进行刺激，于刺激后第12和24小时收集细胞上清液进行 IFN-α和 IFN-β的ELISA检测。

1.3 IFN-α 和 IFN-β 的 ELISA 检测 IFN-α 和IFN-β的ELISA检测试剂盒购自R＆D公司，检测过程按生产商提供的操作说明进行。

1.4 统计学分析 两组资料间的比较采用独立样本t检验或者配对t检验，多组样本间的比较采用单因素方差分析。所有统计学处理均在SPSS17.0 for Windows中完成，定义P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 pSS患者外周血PBMC对Poly I:C刺激呈现高反应性 我们首先分析Poly I:C刺激诱导pSS患者PBMC表达和释放IFN-α和IFN-β的能力。结果发现，50 μg/ml的 Poly I:C可以诱导 pSS患者和健康个体的 PBMC释放 IFN-α和 IFN-β，但pSS患者 PBMC释放 IFN-α和 IFN-β的能力显著高于健康对照(图1A)。我们进一步观察来自pSS患者和健康个体的去除了CD14+单核细胞的PBMC对50 μg/ml的 Poly I:C的反应性。结果发现:在去除了CD14+单核细胞的PBMC中，Poly I:C可以诱导其释放IFN-α和IFN-β，但其释放水平相对较低。虽然在部分时间点上pSS患者与健康个体间的差异有统计学意义，但该两组细胞释放IFN-α和IFN-β的整体差异不显著(图1B)。该结果提示:pSS患者PBMC对Poly I:C刺激具有高反应性，且这种高反应性可能与单核细胞有关。

2.2 pSS患者外周血单核细胞对Poly I:C刺激呈现高反应性 进一步研究发现:50 μg/ml的Poly I:C刺激CD14+单核细胞可以诱导相对较高浓度的IFN-α和IFN-β的释放，且来自于pSS患者的单核细胞，其释放IFN-α和IFN-β的能力显著高于来自于健康个体的单核细胞(图2A)。此外，我们还发现Poly I:C诱导单核细胞释放IFN-α和IFN-β具有浓度依赖性(图2B)。这些结果表明:Poly I:C刺激下pSS患者单核细胞分泌Ⅰ型干扰素能力增强。

2.3 pSS患者血清可以增强单核细胞对Poly I:C的反应性 我们分析了pSS病人或者健康个体血清对单核细胞释放IFN-α和IFN-β的影响。结果发现:不论是来自健康个体的单核细胞还是来自pSS的单核细胞，在含pSS患者混合血清的培养基中，其释放IFN-α和IFN-β的能力明显增强(与含健康个体血清的培养基相比)。另一方面，不论是以含pSS患者混合血清的培养基，还是以含健康个体血清的培养基进行培养，pSS患者单核细胞释放IFN-α和IFN-β的能力均强于健康个体单核细胞(图3)。这些结果表明:pSS的患者的血清可以增强Poly I:C诱导单核细胞释放IFN-α和IFN-β的能力。

图1 Poly I:C诱导pSS患者和健康个体的外周血PBMCs释放IFN-α和IFN-β(n=14)Fig．1 IFN-α and IFN-β were induced by the peripheral blood cells stimulated with Poly I:C(n=14)

图2 Poly I:C诱导pSS患者和健康个体的单核细胞细胞释放IFN-α和IFN-β(n=14)Fig．2 IFN-α and IFN-β were induced by monocytes stimulated with Poly I:C(n=14)

图3 pSS患者血清可以增强Poly I:C诱导单核细胞释放IFN-α和IFN-β的能力(n=4)Fig．3 Serum from pSS patients enhance the production of IFN-α and IFN-β induced by Poly I:C(n=4)

3 讨论

单核细胞是外周血中数量最多的抗原递呈细胞，其细胞表面表达了多种模式识别受体，可以感知外界或者自身的抗原，进而发动针对抗原的免疫炎症反应。已知Poly I:C是一种双链RNA类似物，在抗原递呈细胞上的受体主要是TLR3。Poly I:C通过激活单核细胞内的TLR3可诱导干扰素等多种细胞因子的表达。在正常情况下，这是机体免疫系统应对病毒感染的有力武器，因为干扰素等多种细胞因子不仅具有直接的抑制病毒复制的功能，还可以促进针对病毒的获得性免疫应答过程。然而，Ⅰ型干扰素(包括IFN-α和IFN-β)的产生与释放必需受到精细的调节，失控的Ⅰ型干扰素反应可能会引起组织损伤，甚至自身免疫性疾病［2，9］。

本研究发现，pSS患者的单核细胞对Poly I:C刺激呈现出高反应性，表现在接受Poly I:C刺激后，pSS患者的单核细胞可以释放较多的IFN-α和IFN-β。pSS患者单核细胞的这一异常特性可能与pSS的发生或者发展密切相关。虽然目前对于pSS发生的根本原因尚不清楚，但是已经明确了Ⅰ型干扰素在其发生发展过程中发挥着十分重要的作用［2，7］。此外，研究发现 pSS的发生可能与病毒感染有关［8］。这些已有的研究结果以及本研究提示我们:在外界抗原刺激下，单核细胞过度活化，产生了较高水平的Ⅰ型干扰素可能是pSS发生或者发展的原因之一。

同时，我们还发现，采用pSS患者的血清培养单核细胞本身可以增强Poly I:C诱导IFN-α和IFN-β释放的能力。这表明:在pSS发生或者发展的过程中，单核细胞在pSS的发病进程中，除了固有的“高反应性”这一内因之外，患者血清特有的“辅助活化”功能这一外因仍然不可忽视。

总之，本研究发现pSS患者的单核细胞存在功能异常，且pSS患者的血清可以增强Poly I:C诱导IFN-α和IFN-β释放的能力。提示我们，在pSS的发病进程中，单核细胞发挥着不可忽视的作用，值得深入研究。

1 Fox R I.Sjogren＇s syndrome［J］.Lancet，2005;366(9482):321-331.

2 Mavragani C P，Crow M K.Activation of the type I interferon pathway in primary Sjogren＇s syndrome［J］.J Autoimmun，2010;35(3):225-231.

3 Bave U，Nordmark G，Lovgren T et al.Activation of the type I interferon system in primary Sjogren＇s syndrome:a possible etiopathogenic mechanism［J］.Arthritis Rheum，2005;52(4):1185-1195.

4 Kimoto O，Sawada J，Shimoyama K et al.Activation of the interferon pathway in peripheral blood of patients with Sjogren＇s syndrome［J］.J Rheumatol 2011;38(2):310-316.

5 Gottenberg J E，Cagnard N，Lucchesi C et al.Activation of IFN pathways and plasmacytoid dendritic cell recruitment in target organs of primary Sjogren＇s syndrome［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006;103(8):2770-2775.

6 Hjelmervik T O，Petersen K，Jonassen I et al.Gene expression profiling of minor salivary glands clearly distinguishes primary Sjogren＇s syndrome patients from healthy control subjects［J］.Arthritis Rheum，2005;52(5):1534-1544.

7 Nikolov N P，Illei G G.Pathogenesis of Sjogren＇s syndrome［J］.Curr Opin Rheumatol，2009;21(5):465-470.

8 James J A，Harley J B，Scofield R H.Role of viruses in systemic lupus erythematosus and Sjogren syndrome［J］.Curr Opin Rheumatol，2001;13(5):370-376.

9 Sozzani S，Bosisio D，Scarsi M et al.Type I interferons in systemic autoimmunity［J］.Autoimmunity，2010;43(3):196-203.

10 Vitali C，Bombardieri S，Jonsson R et al.Classification criteria for Sjogren＇s syndrome:a revised version of the European criteria proposed by the American-European Consensus Group［J］.Ann Rheum Dis，2002;61(6):554-558.