不同外源激素对啤酒花茎段芽诱导的影响

2012-09-11蔡子平王宏霞

浙江农业科学 2012年7期

蔡子平，王宏霞

(甘肃省农业科学院啤酒原料研究所，甘肃兰州 730070)

啤酒花 (Humulus lupugusL．)又称蛇麻草、蛇麻花，是荨麻目大麻科葎草属植物，是制造啤酒的原料之一［1］。啤酒花能够赋予啤酒特殊的苦味和独特的风味，并具有一定的防腐性能［2］和医药功能。近年来的研究表明，啤酒花不仅具有镇定、安神、催眠、杀菌、抗炎和利尿等作用，还具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤和植物雌激素样作用等多种功效［3－5］。

啤酒花是一种较耐寒不耐热的植物，主要分布于我国西北地区 (新疆北部、东北、华东及山东、甘肃、陕西等地)。目前，我国啤酒花产量约占全世界的13%，仅次于美国和德国，居世界第3位［6］。我国是世界著名的啤酒花生产和消费大国，随着啤酒消费和生产的迅速增长对啤酒花的产量和质量都提出了更高的要求。品种单一老化、甲酸含量低等问题已成为我国啤酒花种植效益和国际市场竞争力的主要障碍，品种的更新换代迫在眉睫。植物组织培养技术在农作物品种改良方面取得了多方面的成就。啤酒花利用组织培养快繁已有报道，但侧重于病毒分离方面［7］。

组织培养过程中外植体的选择、灭菌时间以及出芽率的高低及苗子质量的好坏将直接影响以后的增殖效果［8］。因此，采用科学的方法快速筛选出合适的外植体及芽诱导培养基将对以后试验的顺利进行有着极为重要的意义。本研究以啤酒花侧枝茎段末为试验材料，对其灭菌时间、外植体木质化程度、外源激素配比等因素进行了筛选，旨在找出适合啤酒花芽诱导的最佳外植体及诱导条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

啤酒花枝条采自甘肃省农业科学院兰州试验地，于2011年5月的早晨采集啤酒花当年生的侧枝带回实验室进行处理。

1.2 材料处理

1.2.1 不同灭菌方法对啤酒花外植体灭菌与芽诱导效果的影响

将取回的啤酒花枝条去除叶片，在洗洁精溶液中用软毛刷刷掉表面灰尘后，用自来水冲洗干净。在超净工作台上，先去掉顶芽，将枝条剪成带1～2对腋芽、长约3.0～5.0 cm茎段，放置于无菌烧杯中。用75%的酒精浸泡30 s后再以0.1%升汞(HgCl2)+吐温做灭菌剂，灭菌时间分别设10，12，14，16 min，共4个处理。灭菌后用无菌水冲洗茎段5～6次，再将茎段两端剪掉，剪成带1对腋芽、长1.5～2.5 cm的小段。将经消毒的侧芽接入到相同的培养基中，相同条件下培养，每处理接种20瓶，每瓶3个，重复3次。培养20 d后统计出芽率、污染率，分析比较不同灭菌时间处理对啤酒花外植体灭菌与芽诱导效果的影响。

1.2.2 不同木质化程度外植体对芽诱导的影响

将外植体侧枝分成3个组，未木质化 (侧枝顶芽及以下第1～3个芽位)作为第1组，半木质化 (侧枝第4～8个芽位)作为第2组，全木质化 (侧枝第9个及以下的芽位)作为第3组。分别以相同的消毒方法将外植体消毒后接入同样的培养基中，相同条件下培养，每处理接种20瓶，每瓶3个，重复3次。统计接种的出芽率，分析不同木质化程度外植体对芽诱导的影响。

1.2.3 不同外源激素对茎段芽诱导及增殖的影响

保持其他培养条件一致，将幼株茎段按照生理极性分别倾斜插入含有不同浓度IBA、6-BA、IAA相互组合的MS培养基中，所添加的 IAA设0.1，0.2 mg·L－12个水平;6-BA 设 0.01，0.05，0.1 mg·L－13 个水平;IAA 设0.1 mg·L－1单水平。每处理接种20瓶，每瓶3个，重复3次。统计芽诱导及增殖情况，分析不同外源激素对茎段芽诱导及增殖的影响。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌时间对外植体灭菌和芽诱导效应

由表1可知，不同灭菌时间对啤酒花外植体的消毒灭菌与芽诱导效果不同。在10～16 min灭菌时间范围内，随着灭菌时间的延长，外植体污染率呈现逐渐降低的趋势，而其死亡率则随着灭菌时间的延长而依次递增，其中以灭菌16 min的外植体污染率最低，为30.56%，而死亡率高达33.89%。

表1 0.1%升汞+吐温灭菌对外植体和芽诱导的效应

从表1中还可看出，随着灭菌时间的延长，外值体芽诱导率呈现先增后降的趋势，当灭菌14 min时，外植体芽诱导率最高为50.00%。因此以0.1%升汞处理外植体14 min效果最好，既能降低外植体的污染率，又能提高芽诱导率。

2.2 不同木质化程度茎段对芽诱导的影响

啤酒花顶端芽因其未木质化，分生能力强，生长速度快，因此，其出芽率最高。但由于芽较幼嫩，消毒较困难，消毒时间稍长易出现白化苗，白化率最高。顶芽以下第4～8芽位处于半木质化程度，芽诱导的出芽率较高，白化率低，污染也相对较少，比较容易消毒，也适合作为芽诱导的材料。第9位及以下的茎段几乎完全木质化，腋芽的出芽率低且污染率高，很难彻底消毒，因此不适合作为芽诱导的外植体。方差分析结果 (表2)表明，未木质化及半木质化茎芽的芽诱导率相对于木质化茎段的芽诱导率差异显著。因此，在啤酒花芽诱导时应用未木质化及半木质化茎段作为外植体。

表2 不同木质化程度茎段对芽诱导的影响

2.3 不同外源激素对茎段芽诱导及增殖的影响

将啤酒花茎段接种到添加不同浓度外源激素的MS培养基上15 d后，叶腋处开始萌芽，再过10 d，腋芽开始抽芽，茎段基部开始出现愈伤组织，但愈伤组织未见分化出芽。一般情况下，一个叶腋萌出3～10个芽。茎芽分化所得茎段可以继续进行继代增殖培养，观测结果见表3。

表3 不同激素配比对啤酒花茎段芽诱导及增殖的影响

表3显示，MS培养基能培育出啤酒花茎段的愈伤组织和不定芽，可作为啤酒花茎段组织培养的基本培养基;6-BA配合IAA和IBA均能诱导出茎段芽的诱导。6-BA配合IAA均能在茎段基部诱导出愈伤组织，但芽诱导率相对较低。IBA和6-BA配合使用芽诱导率及增殖倍数较高。综合分析，处理7诱导率及增殖倍数均最高，可作为最佳芽诱导培养基组合，即 MS+0.2 mg·L－1IBA+0.01 mg·L－16-BA。诱导出的芽生长旺盛粗壮，无褐化现象，芽诱导率为95.2%，增殖倍数为9.1。

3 小结与讨论

在植物组织培养中，外植体的消毒灭菌一般采用升汞作为灭菌剂进行消毒灭菌，灭菌剂和不同处理时间对外植体灭菌效果有不同影响［9］。啤酒花茎段中空，嫩枝密被柔毛和腺毛，给外植体的消毒灭菌带来一定困难。如灭菌处理时间太短，啤酒花外植体的内生菌难以清除，灭菌不彻底，污染严重;但如灭菌处理时间太长，特别是对于幼嫩、未木质化的枝条，由于升汞对组织细胞的毒害较大，容易造成其腋芽受伤或者死亡，导致芽诱导率降低。本研究结果表明，以0.1%升汞处理外植体14 min效果最好，既能降低外植体的污染率，又能提高芽诱导率。

外植体的木质化程度直接关系到腋芽萌发率［10－12］，啤酒花半木质化或未木质化茎段光合产物主要用于腋芽的萌发，营养丰富，含内源激素多，有利于离体培养时芽的诱导和生长。本研究结果表明，啤酒花未木质化和半木质化茎芽的芽诱导率相对于木质化茎段的差异显著。芽诱导时应采用未木质化及半木质化茎段作为外植体。

植物组织培养的成功与否涉及培养基成分、外植体类型、外植体灭菌条件、外源激素的种类与浓度、光照条件及植物体自身的一些生物学特性等，其中外源激素的种类、浓度及其配比对组织培养起着至关重要的作用。本研究结果表明，啤酒花茎段芽诱导最佳培养基配方为MS+0.2 mg·L－1IBA+0.01 mg·L－16-BA，诱导出的芽生长旺盛粗壮，无褐化现象，芽诱导率为95.2%，增殖倍数为9.1。

本研究仅对啤酒花组织培养过程中外植体选择、外植体灭菌条件及茎段芽诱导最佳培养基进行研究，要建立啤酒花组织培养体系，还需要对生根培养基及驯化移栽条件进行进一步研究。

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