致乳糜泻小麦麸质检测方法研究进展

朱晓燕，袁娟丽，陈红兵，高金燕

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047;2.南昌大学中德联合研究院，江西南昌330047;3.南昌大学环境与化学工程学院，江西南昌330047;4.南昌大学生命科学与食品工程学院，江西南昌330047)

小麦是世界上一种主要的经济作物，富含淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质等，具有较高的营养价值，在日常饮食中深受人们的喜爱。但同时，小麦也是一种严重的食物过敏原，可以引发多种过敏性疾病，如哮喘、运动激发过敏症、荨麻疹以及乳糜泻等［1-2］。其中，乳糜泻是遗传易感者因摄入麸质(主要是小麦及其相似谷物的储藏蛋白)而引发的慢性小肠炎症疾病。该病过去被认为是种少见病，且有地域差异，以欧洲，尤其北欧多见，在西方国家的发病率为0.5%～2%［3-5］，我国近年来也报道了多例乳糜泻病例［6-7］。由于人们对乳糜泻认识的不够，许多患者可能会被误诊为普通肠道疾病。但近年来随着对该病发病机制认识的提高和诊断措施的不断完善，发现乳糜泻的患病率较以前明显增高，且在亚洲国家的发病率也呈上升趋势［8］。乳糜泻临床特征主要是肠粘膜绒毛萎缩，从而导致营养吸收不良、腹泻、生长迟缓、贫血、骨质疏松等。目前，无麸质饮食是乳糜泻唯一可靠的治疗方式。我国是小麦消费大国，小麦食品在日常生活中扮演着重要的角色。但这对乳糜泻患者却是一个极大的威胁，因为极少量的麸质就会导致患病，这将严重影响患者的生活质量。而且由于食物配料的多样化，食物的组成变得十分复杂，除了食品组分中标出的人为加入的麸质成分外，食品中其它组分以及各种食品在公用设备使用过程中产生的交叉污染都有可能给乳糜泻患者带来危害。因此，小麦、小麦类制品及其它食物中致乳糜泻小麦麸质的检测显得尤为重要。

1 小麦中致乳糜泻蛋白

小麦麸质(gluten)已明确为小麦中致乳糜泻的蛋白，主要包括麦醇溶蛋白(gliadins)和麦谷蛋白(glutenins)，二者大约占小麦仁储藏蛋白的80%，富含脯氨酸、谷氨酰胺和半胱氨酸残基［9］。其中，半胱氨酸残基对面团的形成和功能起着重要作用，它主要在蛋白间形成分子间二硫键，产生蛋白网状结构，从而对面团的粘弹性产生重要的影响。

麦醇溶蛋白为单肽链，分子量较小，为 30～75ku［10］，通过分子内二硫键、氢键和疏水作用形成球状结构(如图1)，无分子间二硫键，它赋予面筋延展性，是影响小麦面筋烘烤品质的重要因素，主要包含α/β-、γ-、ω-型［11］。其中 α/β-、γ-型醇溶蛋白分子量在30～45ku之间，富含半胱氨酸;ω型醇溶蛋白分子量在45～75ku之间，但半胱氨酸含量较低［12］。

麦谷蛋白(如图1)则是一类非均质的大分子聚合体，包含高分子量蛋白亚基(HMW:80～130ku)和低分子量蛋白亚基(LMW:10～70ku)［9］。其中 HMW亚基又可分为x型和y型亚基，LMW亚基可分为B-，C-和D-型亚基［13］。麦谷蛋白的氨基酸组成多为极性氨基酸，容易发生聚集作用，主要赋予面团弹性并决定面团的强度。

图1 麦醇溶蛋白和麦谷蛋白［14］Fig.1 Schematic image of gliadins and glutenins

小麦麸质是乳糜泻发生的必要条件，研究发现在麸质蛋白上存在许多特异性T细胞刺激性表位，特别是 α/β、γ-醇溶蛋白，HMW-和 LMW-麦谷蛋白上也存在这些表位［15］。这些特定的表位肽段在肠道粘膜固有层被抗原递呈细胞表面的HLA-DQ2(或HLA-DQ8)受体识别，然后被呈递给CD4+T细胞，从而导致细胞因子的产生，最终导致发病［16］。另外，麸质蛋白富含脯氨酸，这种独特的结构特性使得麸质蛋白不容易被胃肠道消化酶完全降解，而生成一些较大的肽段(如长度为33个碱基的肽段)。这些麸质蛋白免疫显性肽可能在肠道内长时间存在，加大了触发T细胞反应的机率。

2 小麦麸质检测方法

目前乳糜泻尚无特效疗法，所以患者严格避免食用含有麸质成分的食物是最佳选择。然而，小麦消费已经遍布世界各地，已跻身于三大消费谷物之一。除了制作烘焙食品和意大利面外，麸质还被当做食品添加剂广泛应用于食品工业中，且麸质也被用来制造个人护理用品、营养品和药品。另外，传统的无麸质产品和不含小麦的产品在生产、加工以及包装过程中，还可能受到交叉污染。显而易见，谷物及谷物片段在食品加工行业中无处不在。此外，最近一项临床实验证实腹腔能够承受的麸质水平是摄入量每天不超过50mg的麸质蛋白［17］，但目前麸质的最低激发剂量未见报道［18］。食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission，CAC)规定无麸质食品的麸质含量不超过20mg/kg［19］。由此可见，食品中麸质含量的准确检测，以及无麸质食品标签的制定，对于乳糜泻患者的健康和安全饮食极为重要。迄今为止，用于麸质含量检测的方法主要包括ELISA法，免疫印迹法，质谱法，以及PCR法。

2.1 酶联免疫吸附(ELISA)法

目前，市场上用于麸质定性和定量的方法主要是ELISA法，该法灵敏性高、特异性强、快速、费用低。用于检测麸质的ELISA商业试剂盒有多种，这些试剂盒主要采用双抗夹心法，检出限范围为2～10mg/kg［20］。但大多数试剂盒主要是基于 Skerritt抗体［21］和 R5 抗体［22］。Skerritt抗体主要是针对ω-醇溶蛋白，R5抗体则针对广泛存在于 α/β-、γ-、ω-醇溶蛋白上的表位，包括 QQPFP、QQQFP、LQPFP、QLPFP等。有研究表明，Skerritt抗体对麦谷蛋白的亲和力较麦醇溶蛋白高［20，22］，R5 抗体对麦醇溶蛋白的亲和力较麦谷蛋白要高［22-23］。但很遗憾，这种亲和力差异对麸质定量的影响在商业检测试剂盒中尚未见报道。

目前，食品法典委员会(CAC)认可的检测麸质含量的方法是基于R5抗体的夹心ELISA法［24］。该法既可以检测天然的麸质蛋白也可以检测加工过的麸质蛋白。但夹心ELISA法也具有局限性，它在检测过程中需要待检抗原含有两个或两个以上可被R5单抗识别的表位。通常，对于许多水解食物，在加工过程中，蛋白被打断成碎片，最后可能只剩下一个毒性表位，在这种情况下，麸质蛋白仍能导致乳糜泻的发生，但却不易被检测出。2011年，应食品法典委员会的要求，Mena等［25］开发出了基于R5抗体的竞争抑制性ELISA，该法可以很好的解决上述问题，其检出限和定量限分别为0.72mg/kg和2.44mg/kg的麦醇溶蛋白。

当然，除了商业试剂盒外，还有许多实验室的方法用于检测麸质［26-28］。这些方法主要是麸质蛋白的提取方法和使用的抗体不同，如 Morón等［26］采用基于 33个碱基肽(LQLQPFPQPQLPYPQPQLP YPQPQLPYPQPQPF)的单抗进行夹心和竞争ELISA，其检出限分别为1mg/kg和0.5mg/kg的麦醇溶蛋白。秦倩茹等［28］建立了检测小麦醇溶蛋白的定量夹心ELISA法，采用的抗体为兔抗醇溶蛋白抗体，定量检出限为7.81mg/kg。此外，还有基于α-、γ-醇溶蛋白肽的单抗和PN3(LGQQQPFPPQQPYPQPQPF)单抗等等，但这些方法均没有得到食品法典委员会的认可。

迄今为止，现有的检测麸质的ELISA方法仍存在缺陷。主要体现在以下几个方面:a.重复性不够高:ELISA法容易受到板包被、加样、洗板、反应温度和时间等许多因素影响，因而造成重复性差;b.易受抗体的影响:由于各种抗体的特异性不同，其检测结果易出现假阳性和假阴性，甚至出现交叉反应;c.检测对象的局限性:目前ELISA商业试剂盒使用的R5抗体和Skerritt抗体检测的都是麦醇溶蛋白，而引发乳糜泻的T细胞表位不仅存在于麦醇溶蛋白上，麦谷蛋白上也含有。理论而言，这两种单抗用于检测致乳糜泻毒性麸质的准确性不如抗T细胞表位的抗体，但这种差异目前并没有得到很好的比较研究。

ELISA方法使用的抗体比较关键，其结果的准确性关系到乳糜泻患者的安全健康饮食。现存的各种检测抗体，包括食品法典委员会认可的R5单抗，都存在着许多争议。目前，并没有统一的用于检测麸质的抗体，因此，急需开发出一种能够准确定量出致乳糜泻毒性麸质的抗体。

2.2 免疫印迹法

根据定量免疫印迹的原理，也可以检测出产品中麸质的含量［29-30］。该法主要是结合SDS-PAGE电泳和免疫印迹。在后期的印迹过程中，也是采用基于麸质的各种特异性抗体。如，Van den Broeck等［30］人开发出了基于T细胞表位的单克隆抗体Glia-α9和Glia-α20，并应用于免疫印迹检测毒性表位。

由于免疫印迹技术的局限性，如在转膜过程中，蛋白质转印的好坏受多种因素的影响，且需根据印迹的强弱来确定麸质的量。因此，该法在麸质蛋白定量的精确性上还有待提高。目前，该法在筛查低致乳糜泻毒性小麦及其他低乳糜泻毒性谷物品种方面的应用比较多。采用此法，可以较直观地比较出各品种麸质蛋白的种类与含量的差异，也可通过印迹的结果鉴定各单抗的特异性程度。

2.3 质谱法

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是第一个使用非免疫技术来检测面粉和食物样本中麸质含量的方法［31］，可以检测面粉、淀粉类食物中的小麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白、黑麦醇溶蛋白以及燕麦谷蛋白。与其它方法相比，该法同样需要样品前处理，但在整个检测过程中不需要使用抗体，而是直接根据质谱模式图定量出醇溶蛋白(25～40ku)。该法对于加工或非加工的麦类食品都适用，其检测线性范围 4～100mg/kg［31］。但是，MALDI-TOF-MS 法不能很好的检测出非致乳糜泻毒性谷物玉米、大米中含有的麦醇溶蛋白，因为大米、玉米本身含有大量的醇溶蛋白，会干扰麦醇溶蛋白质谱信号。为了解决这个问题，Hernando等［32］开发出了两步法提取出小麦醇溶蛋白，并结合MALDI-TOF-MS法检测以玉米、大米为基质的食品中麦醇溶蛋白的含量(30～45ku)，该法的检测线性范围为100～400mg/kg。

由于质谱法用于检测麸质含量低于20～25mg/kg的样本时，效果不好，因而不适用于低麸质水平的食物样本的检测。为了克服MS检测麸质的缺陷，Sealey-Voyksner等［33］建立了一种液相色谱串联质谱(LC-MS)的方法。液质联用法是一种高效的分析技术，将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱具有高选择性、高灵敏度的优点结合起来，可以从复杂的食物基质中检测出目标蛋白，在谷类蛋白研究方面得到了很好的应用。该法主要对各种常见市售麸质类食品和无麸质食品中与麸质密切相关的六个致敏肽(LQPQNPSQQQPQEQVPL、 TQQPQQPFPQQPQQPFPQ、VPVPQLQPQNPSQQQPQEQVPL、RPQQPYPQPQPQY、QPQQPFPQTQQPQQPFPQ和PQQSPF)进行检测，其检测线性范围为0.01～100mg/kg，检出限和定量限分别为1～30μg/kg和10～100μg/kg。液质联用相比于单一的质谱法，对于低麸质含量的食品检测具有较好的效果。

质谱分析具有灵敏度高、样品用量少、分析速度快、分离和鉴定同时进行、质量精度高且结果可靠等优点，因而被广泛运用于化学、化工、医药、材料、生命科学等各个领域。但是，与免疫学检测方法相比，质谱法依赖贵重设备，费用较高、费时费力，不适用于食品行业的现场快速、大量检测。随着科学技术的发展，质谱法有望突破这些障碍，而广泛的运用于食品行业麸质蛋白的检测中。

2.4 聚合酶链式反应(PCR法)

继质谱法后，又出现了另一种非免疫学方法—PCR法，并结合琼脂糖凝胶电泳来检测麸质蛋白的基因［34-35］。这种方法主要是通过体外扩增食品中的目标DNA序列，然后确定其是否含有麸质蛋白。

Debnath等［34］开发出的PCR法主要用于定性检测麦谷蛋白，通过基因扩增，获得麦谷蛋白135bp基因片段的PCR产物，阳性样品通过扩增可以呈现135bp的基因片段。该法的检出限为21.5pg DNA。而柯燕娜等［35］建立了一种常规PCR法，用于检测各种原料和加工食品中的小麦麸质。该法针对小麦的ω-醇溶蛋白设计了一对扩增片段大小为185bp的引物，检出限为10ng。但是，常规PCR法的缺陷是不能定量出麸质含量，而且它检测的只是单一的麦谷蛋白或麦醇溶蛋白的DNA，具有很大的局限性。

值得欣慰的是，随着荧光定量PCR(Q-PCR)的介入，该方法被成功地应用于检测食品中小麦麸质的DNA含量。Mujico等［36］开发出了一种Q-PCR系统用于检测小麦麸质蛋白的DNA，其定量限为20pg DNA，并将此法与R5 ELISA法进行比较。结果发现，除了水解和深加工的食品外，对于其它食品，不仅麸质含量高于1.5mg/kg(R5 ELISA试剂盒定量限)的食物样本，而且麸质含量低于1.5mg/kg的食物样本，Q-PCR都可以检测出阳性信号，表明其敏感性优于R5 ELISA法，是检测食品中是否存在麸质的一种有效的非免疫学方法。

无论是常规PCR还是Q-PCR，其在检测食物基质复杂、麸质含量低的食品上都具有优势。但是麸质成分复杂，表达该蛋白的基因也相应多种多样，以上两种方法每次只能检测某单一蛋白的DNA，且引物的设计和选择比较关键，易出现假阳性或假阴性扩增。同时，即使是Q-PCR也只能定量出DNA的含量，并不能直接获得食物中麸质蛋白的准确含量。

3 结语

乳糜泻是一种与小麦消费密切相关的食物过敏疾病，其发病率随着小麦消费量的增加呈上升趋势。麸质蛋白的准确检测对于低麸质和无麸质产品标签的制定至关重要。同时，也与食品安全控制、标示、安全预警等密切相关。各种检测麸质蛋白的技术除可以保障乳糜泻患者安全消费外，还可运用于其它食物过敏原的检测，是保障食品安全的支撑技术。现有的各种检测技术还存在许多缺陷，随着对乳糜泻发病机制以及麸质蛋白更进一步的了解，更为准确、安全、经济、快速、适用性广、高灵敏性的检测技术将会应运而生。

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