小泛素化修饰基因-1多态性与非综合征型唇腭裂的相关性研究

郭胜胜 章根训 王杨洋 马坚 任红旺 赵桂治 李亚娣 石冰 黄永清，

（1.宁夏医科大学口腔医学院 研究生部；2.宁夏医科大学附属医院 口腔颌面外科，银川 750004；3.四川大学华西口腔医院 唇腭裂外科，成都 610041）

非综合征型唇腭裂（non-syndromic oral clefting，NSOC）是最常见的先天性颅面畸形之一，世界范围内发病率约为1‰～2‰。不同人群NSOC的发病率存在差异[1]，我国新生儿的发病率约为1.82‰[2]。NSOC病因较为复杂，目前普遍认为该疾病是由遗传因素、环境因素及二者的交互作用所致[3-4]。NSOC具有遗传异质性，对不同人群研究所得结果不尽相同。

本课题组研究[5-7]并证实了干扰素调节因子6（interferon regulatory factor 6，IRF6）基因和同源异形盒基因MSX1与NSOC具有相关性。小泛素化修饰基因-1（small ubiquitin-related modifier-1，SUMO-1）编码的小泛素化修饰蛋白是一种修饰蛋白，对T-box transcription factor 22（TBX22）[8]及MSX1[9]基因具有调控作用。因此，有必要研究SUMO-1基因与NSOC是否具有相关性。为此本研究选择SUMO-1基因rs6709162、rs7599810和rs7580433位点，研究和探讨宁夏人群SUMO-1基因位点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与NSOC的相关性。

1 材料和方法

1.1 研究对象

本研究收集2006年1月—2009年12月就诊于宁夏医科大学附属医院口腔颌面外科的NSOC患者核心家系（家族3代以上为宁夏人）为研究对象，共收集唇裂患者55例、腭裂58例、唇腭裂95例，患者父亲189例、患者母亲176例，完整核心家系（患者及其父母）172个。所有病例均排除了其他先天性畸形及综合征型唇腭裂。经宁夏医科大学附属医院伦理委员会讨论通过，签订书面知情同意书后，采集研究对象的外周全血5 mL。此外，收集同期、相同地区出生的正常对照组新生儿284例，抽取脐带血5 mL。

1.2 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms，PCR-RFLP）检测

将收集到的5 mL全血，经柠檬酸葡萄糖溶液抗凝，提取基因组DNA，然后行PCR扩增、酶切及基因分型。引物、内切酶和酶切后的产物片段详见表1。为验证基因分型的正确性，每批试验均设立阳性内对照，同时随机挑选10%的样本直接测序。

表 1 SUMO-1多态位点及引物、内切酶情况Tab 1 Primers and incision enzyme information in SUMO-1 polymorphism sites

1.3 统计分析

对患者双亲和对照组基因型分布进行Hardy-Weinberg（HW）平衡检验。利用SPSS 11.5软件对患者及其父母与对照组基因型和等位基因进行分析，采用传递不平衡检验（transmission disequilibrium test，TDT）及以家系为基础的相关性检验（family based association test，FBAT），分析SUMO-1的rs6709162、rs7599810和rs7580433多态位点与NSOC的相关性，并进行3个位点间组合的单倍型分析。

2 结果

2.1 基因分型结果

对rs6709162、rs7599810和rs7580433多态位点的酶切电泳分型结果如图1～3所示。随机挑选10%的样本直接测序，酶切后分型的结果与测序的结果完全一致。

2.2 HW平衡检验

患者及其父母和对照组基因型的频率分布均符合HW平衡，其结果详见表2～4。

表 2 SUMO-1基因rs6709162位点HW平衡检验结果以及基因型、等位基因的分布和比较Tab 2 Tests of HW equilibrium,genotypes and alleles distribution and comparisons of the SUMO-1 rs6709162

表 3 SUMO-1基因rs7599810位点HW平衡检验结果以及基因型、等位基因的分布和比较Tab 3 Tests of HW equilibrium,genotypes and alleles distribution and comparisons of the SUMO-1 rs7599810

2.3 病例对照分析

病例组与对照组rs6709162、rs7599810和rs758-0433基因型及等位基因的比较见表2～4。其中，rs75-99810位点的TT基因型频率在唇裂组、腭裂组及总病例组（唇裂、腭裂、唇腭裂3组之和）与对照组比较的差异均有统计学意义（P=0.01，P=0.01，P=0.01）。

表 4 SUMO-1基因rs7580433位点HW平衡检验结果以及基因型、等位基因的分布和比较Tab 4 Tests of HW equilibrium,genotypes and alleles distribution and comparisons of the SUMO-1 rs7580433

2.4 TDT分析

TDT分析结果见表5。rs6709162位点的C等位基因在腭裂和唇腭裂患者中存在过传递（P=0.00，P=0.01）；rs7599810位点的T等位基因在唇腭裂患者中存在过传递（P=0.00）；rs7580433位点的G等位基因在唇裂患者中存在过传递（P=0.05）。

表 5 TDT分析结果Tab 5 Results of TDT analysis

2.5 FBAT分析

FBAT参数设定为加性模型（model additive）、双等位遗传模型（mode bi-allelic）、基因型模型（model genotype），进行相关性分析，结果表明：SUMO-1基因的rs7599810位点的C、T等位基因分布的频率有统计学意义（P=0.00，P=0.00），TT基因型的分布具有统计学意义（P=0.00）。rs6709162和rs7580433位点在基因型分布和等位基因分布频率上的差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

NSOC是一类多基因遗传病，具有显著的遗传异质性。目前已经发现与NSOC相关的主要基因有IRF6、MSX1、转化生长因子β1、转化生长因子β3、TBX22等[8，10-13]。SUMO-1基因通过产生小泛素化修饰蛋白对其他基因转录和翻译后的产物进行调控，对维持染色质的结构具有一定的作用[14]。SUMO-1参与调节DNA的修复、调控离子通道，并参与细胞内通路的调控[15]。MSX1转录产物可被类泛素化修饰，并对MSX1的功能进行调控[9]。MSX1作为颌面部发育过程中重要的转录因子贯穿于颌面部发育的全过程，并与其他转录因子相互作用[16]，在颌面部形成中发挥作用。同时，SUMO-1可与靶蛋白结合对Mus musculus stabilin（STAB）基因的表达进行调控[17-18]。SUMO-1还可对TBX22基因进行调控，而TBX22基因的突变可能引起唇腭裂的发生[8]。因此，SUMO-1基因的表达和唇腭裂的发生有着紧密的联系。SUMO-1基因的多态性可以引起单倍剂量不足，继而影响唇腭裂的发生[19]。

本研究从HapMap数据库中选取了SUMO-1基因的3个位点：rs6709162、rs7599810和rs7580433。rs6709162和rs7599810位于SUMO-1基因第1内含子中，rs7580433位于第2内含子中。这3个SNP位点虽然不直接参与蛋白的表达，但可能参与调控SUMO-1基因的复制和转录，以及影响翻译后SUMO-1蛋白的功能；还可能和其他基因共同作用，与唇腭裂疾病的发生具有相关性。患者父母亲及对照组基因型的频率分布均符合HW平衡定律，表明本研究选取的试验对象具有群体代表性。

本研究中对照组rs7599810位点的T等位基因频率为60.4%，与HapMap数据库中北京汉族人群T等位基因频率的65.1%相比较稍低。病例对照分析发现：SUMO-1基因的rs7599810多态性在唇裂组、腭裂组以及总病例组与对照组比较具有统计学差异（P=0.01，P=0.01，P=0.01）；TT基因型在唇裂组、腭裂组的相对危险度分别为2.03（95%CI：1.13～3.64）和1.80（95%CI：0.97～3.34），提示rs7599810位点TT基因型是唇裂、腭裂的危险基因型。TDT分析显示：rs7599810位点的T等位基因在唇腭裂组中存在过传递（P=0.00）。FBAT分析显示：rs7599810位点C、T等位基因分布的频率具有统计学意义（P=0.00，P=0.00），TT基因型的分布具有统计学意义（P=0.00）。上述分析说明rs7599810位点T等位基因过传递和TT基因型与NSOC存在相关性。

本研究中对照组中rs6709162的T等位基因频率为30.1%，与HapMap数据库中北京汉族人群T等位基因频率26.2%相比较稍高。病例对照分析发现：病例组各组与对照组比较，rs6709162位点在基因型分布和等位基因频率分布上的差异均无统计学意义（P>0.05）。TDT分析显示：rs6709162位点C等位基因在腭裂组和唇腭裂组中存在过传递（P=0.00，P=0.01），而在唇裂组则没有统计学意义（P>0.05）。TDT分析结果与病例对照研究所得结果不同，可能是由于病例对照研究中选取了全部的样本而TDT分析中只选取了完整的3人核心家系，排除了群体遗传背景的差异，这恰恰显示了TDT分析的优势，因而更具有可靠性。因此，rs6709162位点C等位基因的过传递和NSOC的发生具有相关性。Jia等[20]的研究结果表明：rs6709162位点C等位基因无过传递（P=0.14），但是增加了患NSOC的风险。该结果与本研究结果有差异，可能跟分组方式、研究人群地域分布及民族差别有关。

本研究中对照组rs7580433位点的A等位基因频率为6.9%，与HapMap数据库中北京汉族人群A等位基因频率7.8%基本一致。病例对照分析结果表明：病例组各组与对照组比较，rs7580433位点在基因型分布和等位基因频率分布上的差异均无统计学意义（P>0.05）。TDT分析显示：rs7580433位点的G等位基因在唇裂组中存在过传递（P=0.05），说明rs7580433位点G等位基因的过传递与NSOC存在相关性。

本研究证实SUMO-1基因rs6709162、rs7599810和rs7580433位点多态性与宁夏人群NSOC的发病具有相关性。由于NSOC是由遗传因素和环境因素及二者的交互作用所致，并且可能和多个基因存在相关性，而SUMO-1基因作为编码小泛素化修饰蛋白的基因，可能和其他基因相互作用，在唇腭裂的发病过程中发挥作用。所以今后的研究需要考虑到其他可能的基因和环境因素以及它们的相互作用，综合起来探讨其对NSOC发病的影响。

[1] Mossey PA,Little J.Epidemiology of oral clefts：An international perspective[M]//Wyszynski DF.Cleft lip and palate：From origin to treatment.Oxford：Oxford University Press,2002：127-158.

[2] Sousa SB,Pina R,Ramos L,et al.Tetra-amelia and lung hypo/aplasia syndrome：New case report and review[J].Am J Med Genet A,2008,146A（21）：2799-2803.

[3] Murray JC.Gene/environment causes of cleft lip and/or palate[J].Clin Genet,2002,61（4）：248-256.

[4] Melnick M.Cleft lip（+/-cleft palate） etiology： A search for solutions[J].Am J Med Genet,1992,42（1）：10-14.

[5] 马坚,黄永清,马敏,等.中国西部人群IRF6基因位点SNP与非综合征型唇腭裂相关性的研究[J].实用口腔医学杂志,2008,24（3）：417-421.Ma Jian,Huang Yongqing,Ma Min,et al.Association between IRF6 V274I and non-syndromic cleft lip with or without cleft palate in west Chinese population[J].J Pract Stomatol,2008,24（3）：417-421.

[6] Huang Y,Wu J,Ma J,et al.Association between IRF6 SNPs and oral clefts in West China[J].J Dent Res,2009,88（8）：715-718.

[7] 马坚,黄永清,马敏,等.宁夏人群MSX1基因CA重复序列多态性与非综合征型唇腭裂相关性的研究[J].现代口腔医学杂志,2009,23（4）：367-369.Ma Jian,Huang Yongqing,Ma Min,et al.Relationship between MSX1 CA repeat and non-syndromic cleft lip with or without palate in Ningxia population[J].J Modern Stomatol,2009,23（4）：367-369.

[8] Braybrook C,Doudney K,Marçano AC,et al.The T-box transcription factor gene TBX22 is mutated in X-linked cleft palate and ankyloglossia[J].Nat Genet,2001,29（2）：179-183.

[9] Gupta V,Bei M.Modification of Msx1 by SUMO-1[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,345（1）：74-77.

[10]Zucchero TM,Cooper ME,Maher BS,et al.Interferon regulatory factor 6（IRF6） gene variants and the risk of isolated cleft lip or palate[J].N Engl J Med,2004,351（8）：769-780.

[11] Otero L,Gutiérrez S,Cháves M,et al.Association of MSX1 with nonsyndromic cleft lip and palate in a Colombian population[J].Cleft Palate Craniofac J,2007,44（6）：653-656.

[12] Loeys BL,Chen J,Neptune ER,et al.A syndrome of altered cardiovascular,craniofacial,neurocognitive and skeletal development caused by mutations in TGFBR1 or TGFBR2[J].Nat Genet,2005,37（3）：275-281.

[13] Reutter H,Birnbaum S,Mende M,et al.TGFB3 displays parentof-origin effects among central Europeans with nonsyndromic cleft lip and palate[J].J Hum Genet,2008,53（7）：656-661.

[14] Wilson BJ.Meta-analysis of SUMO1[J].BMC Res Notes,2008,1：60.

[15] Su HL,Li SS.Molecular features of human ubiquitin-like SUMO genes and their encoded proteins[J].Gene,2002,296（1/2）：65-73.

[16]朱露颖,伍俊,石冰.唇腭裂易感基因的研究进展[J].口腔医学,2008,28（7）：379-381.Zhu Luying,Wu Jun,Shi Bing.Research progress for predisposing genes of cleft lip and palate[J].Stomatology,2008,28（7）：379-381.

[17] Britanova O,Depew MJ,Schwark M,et al.Satb2 haploinsufficiency phenocopies 2q32-q33 deletions,whereas loss suggests a fundamental role in the coordination of jaw development[J].Am J Hum Genet,2006,79（4）：668-678.

[18] Beaty TH,Hetmanski JB,Fallin MD,et al.Analysis of candidate genes on chromosome 2 in oral cleft case-parent trios from three populations[J].Hum Genet,2006,120（4）：501-518.

[19] Alkuraya FS,Saadi I,Lund JJ,et al.SUMO1 haploinsufficiency leads to cleft lip and palate[J].Science,2006,313（5794）：1751.

[20]Jia ZL,Li Y,Meng T,et al.Association between polymorphisms at small ubiquitin-like modifier 1 and nonsyndromic orofacial clefts in Western China[J].DNA Cell Biol,2010,29（11）：675-680.