HPLC法同时测定八号膏中大黄素和大黄酚

高 建， 赵 萍， 夏 泉， 许杜娟，2， 高昌琨

(1.安徽医科大学第一附属医院，国家中医药管理局三级实验室安徽合肥 230022;2.安徽医科大学药学院安徽合肥 230032;3.安徽中医学院药学院安徽合肥 230038)

众所周知，烧伤可引起严重的皮肤损害。中药在烧伤治疗上有其独特优势［1-2］，八号膏是安徽医科大学第一附属医院在上世纪七十年代中西医结合治疗烧伤的研究成果之一，是治疗烧伤的特色中药制剂，具有清热解毒、收敛生肌等功效，主要治疗深Ⅱ度烧伤，大量的临床使用证明其效果显著。八号膏处方由大黄、地榆、五倍子等中药组成，由于其处方组成复杂，至今仍没有明确的质量标准，严重制约其进一步开发和利用，因此对其中主要成分质量控制的研究十分迫切。

大黄具有凉血解毒、逐瘀通经［3］的功效。现代研究表明［4］大黄中的活性成分具有泻下、抗炎、抗菌、抗病毒等作用;此外通过大量阅读文献发现，大黄、冰片等中药在烧烫伤治疗中的使用频率最高。故为建立该制剂的定量分析方法，更好地控制质量，对该制剂进行了定量测定方法的研究，本试验选取大黄中大黄素和大黄酚为指标，运用目前使用广泛的HPLC法进行测定。

1 仪器与试药

Agilent 1100(美国)高效液相仪;Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μL，迪马科技公司)色谱柱;AB135-S十万分之一电子天平 (梅特勒-托利多中国地区生产);SB3200超声波清洗器 (必能信超声公司);电热恒温水浴锅 (上海医疗器械五厂)。

八号膏 (安徽医科大学第一附属医院制剂中心生产，批号:20111021，20120110，20110724，20110821，20111222，20110623，20110305，20110725);大黄素对照品 (中国药品生物制品检定所，批号:110756-200110)、大黄酚对照品(中国药品生物制品检定所，批号:11796-200615)、大黄酸对照品 (中国药品生物制品检定所，批号:110757-200206)、芦荟大黄素对照品 (中国药品生物制品检定所，批号:110795-200806)、大黄素甲醚对照品 (中国药品生物制品检定所，批号:110758-200611)。甲醇 (色谱纯，美国Tedia公司)，灭菌注射用水 (超纯水，湖南科伦制药有限公司);甲醇 (分析纯，上海润捷化学试剂有限公司)，85%磷酸，石油醚溶液等。

2 方法与结果

2.1色谱条件 DiamonsilC18(4.6 mm×250 mm，5 μm，迪马科技公司)，phenomenex保护柱，柱芯 (3 mm×4 mm);流动相为甲醇-0.1%磷酸 (85∶15)，进样量10 μL;检测波长254 nm;体积流量1.0 mL/min;柱温30℃。在此条件下大黄样品中两种对照品与其他组分均能达到基线分离，见图1。

图1 对照品 (A)、制剂 (B)、大黄对照药材 (C)和阴性对照 (D)HPLC色谱图

2.2 对照品溶液 精密称取大黄素对照品和大黄酚对照品适量，加入甲醇溶液定容，制成大黄素质量浓度为0.105 g/L，大黄酚质量浓度为0.103 g/L的对照品贮备液。

2.3 供试品溶液 取八号膏约5 g，精密称定，加45 mL 20%硫酸，超声20 min酸化;于3 000 r/min离心机中离心10 min，弃去酸液后，滤渣加40 mL石油醚超声15 min滤过，滤渣加20 mL石油醚超声15 min，滤过，合并两次石油醚溶液，于60℃下挥干溶剂，加甲醇溶解后定容至10 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液 按照八号膏的制备工艺，制备缺少大黄的阴性样品，并按2.3项下方法制成阴性对照溶液。

2.5 线性关系考察 精密称取大黄素对照品贮备液，甲醇稀释至5种不同质量浓度的对照品溶液;精密称取大黄酚对照品贮备液，甲醇稀释至5种不同质量浓度的对照品溶液。以上系列标准溶液在2.1项下色谱条件下，进样10 μL，测定各组分峰面积。以峰面积为纵坐标 (Y)，以进样量 (μL)为横坐标 (X)，绘制标准曲线，计算其回归方程及线性范围。大黄素:Y=2 301X-9.604 1，r=0.999 9，线性范围:0.016 41～0.522 μg;大黄酚:Y=420 6.8X-15.55，r=0.999 9，线性范围:0.016 10～0.515 μg。

2.6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积，大黄素、大黄酚的日内精密度RSD(n=5)分别为0.35%、0.15%。精密吸取相同对照品溶液10 μL，连续进样3 d，每天3次，记录峰面积，大黄素、大黄酚的日间精密度RSD分别为0.27%、0.37%。

2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，在相同色谱条件下，分别在0、2、4、6、12、24 h进样，测得大黄素峰面积RSD为2.7%(n=6)、大黄酚峰面积RSD为2.9%(n=6)，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 重复性试验 取同一批号供试品，按2.3项下供试品溶液制备方法制备6份，在上述相同色谱条件下进行测定，测得供试品中大黄素峰面积RSD为2.7%(n=6)，大黄酚峰面积RSD为2.1%(n=6)。

2.9 加样回收率试验 精密称取八号膏6份，按2.3项下制备供试品溶液，在相同色谱条件下进行测定，测得其中大黄素和大黄酚的浓度。分别精密移取上述溶液各100 μL，精密加入混合对照品溶液100 μL，进样量为10 μL，分别计算大黄素和大黄酸的加样回收率，结果见表1。

2.10 供试品定量测定 取8个批次的八号膏，按2.3项下制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，按上述色谱条件，每批次供试品溶液分别连续进样3次，分别计算每批次供试品溶液中大黄素、大黄酚的平均质量分数及RSD，并计算大黄素和大黄酚的相对保留值，结果见表2。

表1 加样回收率实验结果 (n=6)

表2 不同批次八号膏测定结果 (n=8)

3 讨论

3.1 提取方法的选择［5-7］经甲醇、乙醇、三氯甲烷等提取溶剂以及超声、回流等提取方法比较，发现酸化后，加热回流方法破坏了一部分蒽醌类成分;由于超声提取在常温下进行，较之加热回流方法，蒽醌类成分不容易被破坏且提取更完全，因此选择超声法进行提取。

3.2 流动相的选择 通过阅读参考文献 ［8-12］和查阅2010年版《中国药典》［3］，以及预实验中使用的流动相如:甲醇-0.1%磷酸 (85∶15)、甲醇 -乙腈 -0.1%磷酸(23∶42∶35)、乙腈-0.1%磷酸 (85∶15)等，最终选择甲醇-0.1%磷酸 (85∶15)为流动相，分离完全，峰形较好且出峰时间最短，适合对八号膏中两种蒽醌类成分的同时测定。

3.3 实验意义 烧伤制剂八号膏由大黄、地榆、五倍子等中药组成，其中大黄为主药之一。其含有游离的蒽醌类衍生物如大黄素、大黄酚、大黄酸等，它们对多种病毒和细菌具有抑制和杀灭作用［4］。所以制剂中大黄有效成分含有量的高低是评价其质量的重要标准之一。蒽醌类含有量测定方法文献报道较多，但多集中在大黄药材中蒽醌类成分的含有量测定，提取方法和色谱条件多种多样;而制剂则往往是单一成分的测定。经过多次预实验发现，八号膏制剂中含有5种蒽醌类成分，其中大黄素、大黄酚的含有量均较高，其余3种成分含有量较低，故本实验选择大黄素、大黄酚作为含有量测定的指标成分，对烧伤制剂八号膏中大黄的含有量测定方法进行研究，为八号膏及含有大黄的中药制剂的质量标准的制定提供实验依据。

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