HPLC法同时测定香连片中两种内酯

谢友良， 刘常青， 童玉林， 李生梅， 蒋东旭， 赖小平

(1.广州中医药大学新药研究开发中心，广东广州 510006;2.东莞广州中医药大学中医药数理工程研究院，广东东莞 523808)

香连片是由传统中成药香连丸经改变剂型而得，为泄泻类非处方中成药，该药品处方来源于《太平惠民和剂局方》，由黄连 (吴茱萸制)、木香加工制成，为糖衣片或薄膜衣片。具有清热化湿，行气止痛的功效，临床主要用于大肠湿热所致的痢疾，肠炎、细菌性痢疾等。现代药理研究表明，该方能清热燥湿，行气止痛，有解痉，抗病原微生物及增强免疫功能等作用。

其临床应用广泛，但质量控制却不完善。《中国药典》(2010年版)［1］用薄层色谱法鉴别该药品中的木香和黄连，却只对该药品中盐酸小檗碱用薄层扫描法作定量分析。文献［2-3］也多以盐酸小檗碱的含有量为定量测定指标，而尚未见有对该制剂木香中木香烃内酯和去氢木香内酯作定量测定的报道。木香为处方中的主药之一，其有效成分在该制剂中发挥重要作用。因此仅仅从黄连中含有的小檗碱作定量分析具有一定局限性，有必要对木香药材中药效成分进行定量控制，以规范、优化该制剂的生产工艺，提高其质量标准，确保临床用药的安全、有效。本研究通过建立香连片中木香烃内酯和去氢木香内酯的HPLC定量测定方法，以完善质量控制标准，监控香连片的生产水平，确保产品质量稳定，确保临床用药的安全、有效，有一定的参考价值。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC—20A(UV/Vis)高效液相色谱仪 (日本岛津公司，配有 DGU—20As prominence degasser，LC—20AT prominence liquid chromatograph， SIL—20A promience auto sampler，CTO—20A prominencecolumn oven，SPD—20A prominence UV/Vis detector);KQ5200DA型数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司);SHZ—D(Ⅲ)型循环真空泵 (巩义市予华仪器有限责任公司);N—1001型旋转蒸发仪 (上海爱朗仪器有限公司);实验室专用超纯水机 (重庆利迪现代水技术设备有限公司);CP225D sartorius十万分之一电子天平 (广州市正一科技有限公司);AB204—N电子天平 (METTLET TOLEDO)。

1.2 试药 木香烃内酯对照品 (批号111524-200804，供定量测定用)，去氢木香内酯对照品(批号111525-200404，供定量测定用)，均购自中国药品生物制品检定所;黄连 (产地四川，批号090701);木香 (产地云南，批号20090801);吴茱萸 (产地贵州，批号 20090601)。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。香连片样品3批 (批号:080302、081002、090103)，均为湖北香连药业有限责任公司生产。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 kromasil-C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1(采集时间为40 min);体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;检测波长225 nm。在此色谱条件下测定，木香烃内酯和去氢木香内酯的保留时间分别为31.7 min，34.8 min，分离度均大于1.5。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution mode of mobile phase

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取木香烃内酯、去氢木香内酯对照品0.009 48 g、0.009 36 g，加甲醇溶解定容，分别制成质量浓度为0.948 mg/mL、0.936 mg/mL的单一对照品贮备液。

分别吸取1 mL贮备液混合于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成对照品混合液 (含木香烃内酯0.189 6 mg/mL，去氢木香内酯0.187 2 mg/mL)。

2.3 专属性试验

2.3.1 阴性样品的制备 按香连片的处方比例及工艺制法制成不含木香的阴性样品，按供试品溶液的制备方法操作，制得阴性样品溶液。

2.3.2 测定 在上述色谱条件下，分别精密吸取供试品溶液、对照品混合液、阴性样品溶液10 μL分别注入液相色谱仪，测得结果为阴性样品色谱图中在与木香烃内酯、去氢木香内酯对照品混合液以及供试品色谱图相应的保留时间处无色谱峰出现，表明处方中其他组分对木香烃内酯和去氢木香内酯的测定无干扰，结果见图1。

图1 香连片HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of Xianglian Tablets

2.4 线性关系考察 精密吸取对照品混合溶液4、8、10、15、20 μL，分别注入高效液相色谱仪，测定峰面积值。以进样量X(μg)对峰面积Y进行回归处理，得回归方程。木香烃内酯回归方程为Y=981 499X+51 498，r=0.999 9;去氢木香内酯回归方程为Y=1 376 537X+105 251，r=0.999 9。结果表明木香烃内酯进样量在0.758 4～3.792 μg之间，线性关系较好;去氢木香内酯进样量在0.748 8～3.744 μg之间，线性关系较好。

2.5 供试品溶液的制备 取本品20片，除去薄膜衣，研细。取粉末约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，超声处理30 min(250 W，40 kHz)，放置使其冷却，过滤，残渣用甲醇洗涤3次。滤液置旋转蒸发仪中，回收甲醇，残渣加甲醇溶解转移至5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.6 精密度试验 在选定的色谱条件下，精密吸取上述对照品混合液10 μL，重复进样5次，测定木香烃内酯和去氢木香内酯的峰面积，代入标准曲线方程计算含有量，得RSD值。结果木香烃内酯和去氢木香内酯的RSD分别为2.49%与2.08%，表明精密度良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品10 μL分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定，记录峰面积，代入标准曲线方程计算含有量，得RSD值。结果木香烃内酯和去氢木香内酯的RSD分别为2.72%、2.34%。表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验 精密称取同一批次 (批号090103)的样品粉末6份，分别按2.5项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，代入标准曲线方程计算含有量，得供试品中木香烃内酯和去氢木香内酯的含有量分别为67.68 μg/片、35.47 μg/片，RSD分别为1.9% 和1.2%，表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取已知含有量的香连片供试品 (批号090103)6份，每份10片，每份中分别精密加入一定量的木香烃内酯、去氢木香内酯对照品贮备液，按供试品溶液制备项下操作，进样测定，记录峰面积，代入标准曲线方程计算含有量，得供试品中木香烃内酯和去氢木香内酯的回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests

2.10 样品测定 取香连片3批，按供试品溶液制备项下方法处理后测定，记录峰面积，代入回归方程计算样品中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量，结果见表3。

结果显示，香连片不同批次的两种被测活性成分的含量存在差异，批次090103含量最高，081002次之，080302含量最低。

表3 样品测定结果 (n=3)Tab.3 Determination results of three batches of samples(n=3)

3 讨论

3.1 在流动相选择方面，参考相关文献［4-12］，本实验先后选用了甲醇-水 (65∶35)、甲醇-水(67∶33)甲醇-乙腈-水 (60∶5∶35)、甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-水梯度洗脱 (见表1)，结果以甲醇-水梯度洗脱时木香烃内酯和去氢木香内酯的峰形较好，分离度达到要求。

3.2 在研究中发现，柱温对色谱分离效果影响较明显，先后尝试25℃、30℃、35℃，表明柱温为30℃时分离效果最好。

3.3 各批次间含有量测定差异较大，可能受投料，原药材质量，生产环节，贮藏等因素的影响，另有文献报道［13］，木香烃内酯和去氢木香内酯在水溶媒中不稳定，水蒸气蒸馏法提取的挥发油中木香烃内酯含有量很少，而去氢木香内酯含有量较高，提示在含有木香的制剂生产中，由于生产过程工艺不同，溶媒、温度、加热时间对两种成分的影响亦不同，从而导致产品质量不均一。鉴于此，更有必要对香连片中的有效成分进行测定，以保证临床疗效。

［1］国家药典委员会.中国华人民共和药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:894-895.

［2］高美英，游贵君.反相高效液相色谱测定香连片中盐酸小檗碱的含量［J］.福建中医药，2003，34(4):39-40.

［3］吴建龙，简炎林.高效液相色谱法测定香连片中小檗碱的含量［J］.广东药学，2004，14(4):14-15.

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