夏桑菊颗粒质量标准研究

2012-09-06林丽美许招懂姚江雄刘菊妍王智民

中成药 2012年8期

林丽美，许招懂，姚江雄，刘菊妍，李春，王智民*

(1.湖南中医药大学，湖南长沙 410208;2.广州星群 (药业)股份有限公司，广东广州 510288;3.广州医药集团有限公司，广东广州 510130;4.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

夏桑菊颗粒为夏枯草、桑叶、野菊花三味药材经加工制成，具有清肝明目，疏风散热，除湿痹，解疮毒之功效。用于风热感冒，目赤头痛，高血压，头晕耳鸣，咽喉肿痛，疔疮肿毒等症，并可作清凉饮料。

夏桑菊颗粒原标准收载于中华人民共和国卫生部标准 (部颁标准)第15册，标准编号:WS3-B-2967-98。原标准收载了该药品的处方、制法、性状、鉴别、检查、主治与功能、用量与用法、规格和贮藏9个项目。根据国家药品标准提高行动计划的要求，对夏桑菊颗粒原标准进行修订。由于夏桑菊颗粒的君药是夏枯草，参考2010年版《中国药典》选择夏枯草主要药效成分迷迭香酸为质控指标［1］。现有采用紫外-可见分光光度法和HPLC方法对夏枯草中迷迭香酸含有量进行了测定［2-4］，但是对夏桑菊颗粒中迷迭香酸的含有量测定尚没有报道。同时夏桑菊颗粒组成药材野菊花中最为代表性成分为蒙花苷。因此，本实验增加了夏桑菊颗粒中迷迭香酸和蒙花苷TLC鉴别和HPLC定量测定，为提高夏桑菊颗粒的质量标准提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 KQ—100B型超声波清洗器 (昆山超声仪器有限公司);BPZ11D型电子分析天平 (Sartorius公司);Waters2695-2996高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器(Waters公司)。

1.2 试剂甲醇 (色谱纯，TEDIA公司)，乙腈(色谱纯，Fisher公司)，水为娃哈哈纯净水;三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、甲酸、浓硫酸 (分析纯，北京化工厂)，香草醛 (武汉远城科技发展有限公司);聚酰胺薄膜和硅胶G薄层板 (青岛海洋化工厂)。

1.3 对照品及样品对照品迷迭香酸和蒙花苷(本课题组自制，纯度大于98%)［5］;夏桑菊颗粒从市场上购买。TLC鉴别试验样品具体信息见表1。

表1 TLC中夏桑菊颗粒样品信息Tab.1 Samples of Xiasangju Granules for TLC

2TLC鉴别

2.1 TLC条件迷迭香酸展开剂为三氯甲烷-甲醇-甲酸 (8∶2∶0.5);温度20℃;相对湿度38%;紫外光灯为365 nm;显色剂为1%香草醛浓硫酸，在105℃加热至斑点清晰。蒙花苷乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水 (15∶15 ∶6 ∶4 ∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝乙醇溶液，热风吹干，置紫外光灯 (365 nm)下检视。

2.2 对照品的制备取对照品迷迭香酸和蒙花苷适量，精密称定，加甲醇溶解，配置成质量浓度分别为0.307 4 mg/mL和0.100 3 mg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品制备分别取夏桑菊颗粒样品，阴性对照 (缺夏枯草或缺野菊花)10 g，加甲醇15 mL，超声30 min(功率250W，频率40 kHz)，取出，静置，放凉，过滤，滤液分别作为夏桑菊颗粒的供试品溶液和相应阴性对照溶液。

2.4 鉴别分别取各样品溶液15 μL，按照2.1项TLC条件进行。供试品色谱中，在与对照品色谱的相应位置上，有相同颜色的斑点，而阴性对照没有相应斑点，表明迷迭香酸为夏桑菊颗粒君药夏枯草中的成分，蒙花苷为野菊花中的成分。按照上述条件所得的TLC图谱见图1～3。

图1 TLC图谱 (UV 365 nm)Fig.1 Chromatogram of TLC(UV 365 nm)

图2 TLC图谱Fig.2 Chromatogram of TLC

图3 TLC图谱 (UV 365 nm)Fig.3 Chromatogram of TLC(UV 365 nm)

3 HPLC定量测定

3.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);体积流量1.0 mL/min;检测波长329 nm;柱温30℃;样品温度20℃;进样体积10 μL;分离迷迭香酸和蒙花苷的流动相分别为20%乙腈-80%水 (含1.0% 乙酸乙酯)和25%乙腈-75%水 (0.5%磷酸)等度洗脱。按照上述色谱条件，迷迭香酸和蒙花苷分离很好，无干扰，所得色谱图见图4和图5。

图4 对照品 (A)、夏桑菊颗粒 (B)和缺夏枯草阴性对照样品 (C)HPLC色图谱Fig.4 HPLC chromatograms of reference substance(A)，Xiasangju Granules(B)and negative samples without Prunella vulgaris(C)

图5 对照品 (A)、夏桑菊颗粒 (B)和缺野菊花阴性对照样品 (C)HPLC色图谱Fig.5 HPLC chromatogramsofreferencesubstance(A)，Xiasangju Granules(B)and negative samples without Chrysanthemum indicum L.(C)

3.2 供试品溶液制备称夏桑菊颗粒约2.5 g，精密称定，加甲醇10 mL，称质量，超声30 min(功率250W，频率40 kHz)，取出，静置，放凉，补质量，0.22 μm微孔滤膜滤过，HPLC分析。

3.3 标准曲线的绘制取迷迭香酸和蒙花苷对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，定容，分别得质量浓度为 0.22 μg/μL 和 0.050 5 μg/μL 的对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液1、2、3、5、10、15、20、25、30、40 μL进样分析，记录按上述色谱条件测定的峰面积。以峰面积为纵坐标 (Y)，进样量 (μg)为横坐标 (X)，得迷迭香酸回归方程Y=4 541 216.83X-411 008.21(r=0.999 9)，线性范围为0.22～8.80 μg。蒙花苷线性方程Y=1 734 753.44X+546 792.12(r=0.999 6)，线性范围为0.101 ～2.02 μg。

3.4 精密度试验分别精密吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样6次，按上述色谱条件测定迷迭香酸和蒙花苷的峰面积，其RSD为0.50%和0.62%。

3.5 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别在2、4、6、8、10、12、24 h进样，按上述色谱条件测定迷迭香酸和蒙花苷的峰面积，其RSD为1.01%和0.98%。

3.6 重复性试验取同一份样品6份，精密称定，按照3.2项下制备供试品溶液，按上述色谱条件测定迷迭香酸和蒙花苷的峰面积，其RSD为0.77%和1.22%。

3.7 回收率试验取同一批已知含有量的夏桑菊颗粒样品约1.25 g，6份，精密称定，分别精密加入一定量迷迭香酸和蒙花苷对照品溶液，按3.2项制成加样供试品溶液，按上述色谱条件测定含有量，计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收率试验 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests(n=6)

3.8 样品测定按照上述色谱条件，将不同厂家的样品进行处理和进样，每一个相同厂家及批号的样品称3份，采用外标两点法计算夏桑菊颗粒中迷迭香酸和蒙花苷的含有量，计算平均值。结果见表3。

4 讨论

4.1 到目前为止，中成药质量标准的研究一般以TLC和HPLC方法为主，采用合适的指标建立其标准［6-10］。因此，本实验以特征成分迷迭香酸和蒙花苷为指标，采用TLC和HPLC建立大品种夏桑菊颗粒的质量标准。

4.2 在建立迷迭香酸TLC方法时，展开剂选择采用了三氯甲烷-甲醇、三氯甲烷-甲醇-水、三氯甲烷-甲醇-甲酸和乙酸乙酯-正丁醇等系统，结果发现三氯甲烷-甲醇-甲酸系统最为合适;在显色后，一定要加热，加热到斑点清晰即可。在建立HPLC方法时，如果方法选择不当的话，阴性一直显示有干扰，关键是要注意温度的控制。

4.3 采用TLC的方法分析迷迭香酸和蒙花苷在夏桑菊颗粒中的对应关系，结果说明供试品色谱中，在与对照品色谱的相应位置上，有相同颜色的斑点，而阴性对照没有相应斑点;迷迭香酸仅存在于夏桑菊颗粒组成君药夏枯草之中，而桑叶和野菊花中没有该化合物;蒙花苷仅存在于野菊花中，夏枯草和桑叶均不含该化合物。因此，该方法不仅简单，易重复，而且具有明显的实用性，可以作为夏桑菊颗粒的质量标准之一。

表3 样品测定结果 (n=3)Tab.3 Results of sample determination(n=3)

4.4 采用HPLC方法建立了夏桑菊颗粒中迷迭香酸和蒙花苷的定量测定方法。样品处理容易、可控，所建立的色谱条件简单，分析时间在15 min以内，等度洗脱，适宜于夏桑菊颗粒大量样本中该化合物含有量测定，有很好的实用性;结果表明，所测样品中迷迭香酸和蒙花苷的含有量差别很大，说明现在市面上流通的夏桑菊颗粒的质量参差不齐，但是迷迭香酸含有量高的厂家其蒙花苷含有量也相对较高，估计可能与各厂家的工艺过程密切相关。根据上面所得的结果可以发现，部分生产厂家夏桑菊颗粒含迷迭香酸和蒙花苷较多，且比较稳定，建议增加夏桑菊颗粒中迷迭香酸和蒙花苷的含有量测定，其中迷迭香酸含量不少于1.50 mg/袋，蒙花苷含量不少于0.50 mg/袋。

总之，中药质量标准是一个复杂艰巨体系［11］，但其重要性激励着科研工作者不断的探索和创新［12-13］。夏桑菊颗粒质量标准也是一个开放的系统，每一环节的质量标准共同组成夏桑菊颗粒的质量标准体系，达到有效控制夏桑菊颗粒质量的目的。

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