利用溶剂结晶法纯化环维黄杨星D*

高艺歌，李思思，和琳琳，王高峰

(1.河南省康利医药技术开发有限公司，河南郑州450044;2.黄河科技学院医学院，河南 郑州450001)

环维黄杨星D为黄杨科植物小叶黄杨Buxus microphylla Sieb.et Zucc.var.sinica Rehd.et Wils.及其同属植物中提取而得的生物碱，是《中国药典》收录的国家基本心血管治疗药物，功能是行气活血、通络止痛，用于气滞血淤所致的胸痹心痛、脉结代、冠心病、心律失常见上述症候者。用量:1～2 mg，每日2～3次，每日用量2～6 mg，属于微量用药范围。作为一个天然药物，如此微量的用量便具备很强的心血管生理活性，预示了该药物不同凡响，具有很大的潜在续开发价值。黄杨宁的成分为环维黄杨星D。现代医学理论［1］揭示黄杨宁的药理活性有以下5个方面:①对脑血栓所致损伤的治疗作用;②对心肌缺血所致心律失常、心肌梗死的治疗作用;③抗心律失常和治疗心肌衰竭的治疗作用;④强心作用;⑤改善微循环的作用。最新的药理学研究［2］显示:黄杨宁对钾离子通道具有阻滞作用，可归属于三类抗心律失常药使用。因为环维黄杨星D是一个在心脏部位具有多靶点、强药理活性的天然植物单体药物，所以其具有进一步深入开发的良好前景。

1 背景概述

在2002年至2006年之间，我国新药开发领域曾出现过环维黄杨星D新制剂的开发热潮。期间围绕黄杨宁新药开发的专利申报有30多件，申报的新药品种包括胶囊剂、滴丸剂、软胶囊剂、分散片、口腔崩解片、缓释制剂、控释制剂、复方制剂、小体积注射剂、大体积注射剂、粉针剂等近十几个品种，参与制剂研究并已经在国家食品药品监督管理局申报新药的研究单位多达几十家，是与葛根素、灯盏花素等天然植物提取药物深入开发同时闪亮的中药新药开发亮点。

但是自2006年之后，除了一个环维黄杨星D的分散片获准上市之外，再没有环维黄杨星D的新的药物制剂获得注册批准，其中一个重要的原因就是环维黄杨星D的纯度问题没有得到很好的解决。

目前环维黄杨星D作为中药提取物被收录在《中国药典》一部中，其质量标准规定的纯度为99.0%。然而截止到目前为止，市场上可以购买到的环维黄杨星D的纯度在86%～92%。用于生产环维黄杨星D口服制剂黄杨宁片所使用的原料就是这种达不到《中国药典》规定纯度的环维黄杨星D。

多年来，围绕环维黄杨星D研究的技术人员从来没有放弃过对环维黄杨星D纯化的研究，以求真正获得99.0%以上纯度的有效生产工艺。有人采用选择性合成然后再分离纯化的方法，尽管有文献［3］报道得到了高纯度的产品，但是由于所采用的检测方法不能提供高纯度的有效证据，所以这种纯化工艺被质疑。笔者认为环维黄杨星D中存在的杂质是与主成分结构极其相似的生物碱。由于它们的结构相似，所以具备非常类似的理化性能，尤其是溶解度等方面的性能非常接近，因此选择性合成纯化工艺难以在化学反应中只选择环维黄杨星D产生反应而不选择结构类似的同系物杂质。如果一些同系物杂质也将随之一同参与化学反应，则这种纯化工艺难以实现纯化之目的。

也有人采用柱分离的方法［4－5］，尽管从分析级别的色谱柱上可以获得纯化的样品，但这种工艺难以实现放大来满足工业化生产的需要。这是因为环维黄杨星D在采用柱分离时，同系物杂质与环维黄杨星D的分离度比较小，小的柱分离度尽管可以满足分析的需要，但是移植到工业化生产的大型分离柱时，杂质和主成分的分离度将更进一步缩小，同时对分离现场的检测也存在技术难度，由此而来将进一步增大柱分离的难度。尽管有文献报道［4－5］采用柱分离的方法获得了纯度可以达到99.0%的环维黄杨星D，但是这种方法是难于放大生产的。

2 纯化方法的研究结果

笔者通过研究得知环维黄杨星D在形成结晶体时是通过两个环维黄杨星D分子靠N…H分子间结合力成健形成晶胞。结构示意图如图1所示，进一步的单晶测定环维黄杨星D的空间堆积结构，如图2所示。

笔者通过研究获得在特定的温度和温度曲线条件下，环维黄杨星D可以与甲醇形成甲醇溶剂结晶体，环维黄杨星D与甲醇所形成的溶剂结晶体的结构示意图如图3所示，进一步测定环维黄杨星D与甲醇溶剂结晶体的空间堆积结构如图4所示。

图3 环维黄杨星D与甲醇所形成的溶剂结晶体的空间结构示意图

图4 环维黄杨星D与甲醇所形成的溶剂结晶体的空间结构图

当化合物可以形成结晶体时，如果没有外来化合物参与到该化合物结晶体内部，则结晶体内部是不存在杂质的，因此结晶体产物一般来说纯度都比较高。然而，当只有两个环维黄杨星D结合所形成的结晶体为空间尺寸很小的粉末或针状形态时，结晶体的表面积比较大，一些杂质特别是与环维黄杨星D结构非常相似的同系物杂质，被吸附在环维黄杨星D晶体的表面。由于这些结构相似的杂质成分在理化性质上也与环维黄杨星D相似，所以空间尺寸微小的环维黄杨星D结晶体表面就吸附了大量的结构相似、理化性质接近的杂质成分，而采用溶剂清洗的方法难于洗涤干净这些吸附在结晶体表面的杂质，这就是环维黄杨星D产品纯度不高的实质性因素。

当环维黄杨星D与甲醇形成溶剂结晶时，由于甲醇分子的介入，所形成的结晶体是由两个甲醇分子与四个环维黄杨星D分子交叉组合而成。由于这种特殊的结构形态，环维黄杨星D与甲醇形成的溶剂结晶体的空间尺寸增大了很多，这样一来就大幅度地降低了结晶体的表面积，由于结晶体表面积的增大，结晶体表面所吸附的其他同系物杂质就大幅度减少，所以环维黄杨星D与甲醇所形成的溶剂结晶体的纯度就得到大幅度的提升。

环维黄杨星D与甲醇所形成的溶剂结晶体中由于存在甲醇，显然不能直接取代环维黄杨星D的目前药学注册地位。将环维黄杨星D与甲醇所形成的溶剂结晶体溶解到乙醇溶剂中再重新结晶，就可以得到由两个环维黄杨星D分子结合而成的环维黄杨星D晶体。有这种方法获得的环维黄杨星D的纯度几乎与一甲醇结晶体的纯度一致。一般情况下，通过两个循环的重结晶纯化，就可以获得99.0%的化学纯度。

3 研究意义

目前由于现有的环维黄杨星D标准采用非水滴定方法进行纯度检测，这种方法是对总生物碱检测的方法，所以不能有效地分别检测环维黄杨星D与其他结构类似的杂质，检测方法的专属性差，已经不能满足环维黄杨星D质量控制的要求。提高药品质量标准的技术水平是保障药品质量的有效方法。国务院国发〔2012〕5号文件—国务院关于印发国家药品安全“十二五”规划的通知中指出:最新公布的国家医药安全十二五规划将提高药品质量标准水平作为进一步保障我国药品安全的基本手段。因此，环维黄杨星D质量标准的提升迫在眉睫。在环维黄杨星D质量标准提升以后，目前市场销售的低纯度环维黄杨星D原料将不能符合质量标准99.0%纯度的要求，所以本文介绍的纯化方法将会有效地应用于环维黄杨星D的工业化生产中。

［1］方泰惠.中药现代化代表药物－环维黄杨星D药理研究进展［C］.中药(新型制剂)专业委员会成立大会和首届学术研讨会论文集，北京大学，2004:80－87.

［2］刘红军，余海滨，朱明军，等.环维黄杨星D对豚鼠心室肌细胞膜电位的影响［J］.中国药理与临床，2009，25(6):39－42.

［3］胡国强，许启泰，张保国，等.环维黄杨星D分离方法改进［J］.中国天然药物，2004，2(3):155－156.

［4］杭太俊，夏合柱，刘洁，等.环维黄杨星D的制剂:中国，CN1864690A［P］.2006－11－22.

［5］徐新盛，文艳秋.环维黄杨星 D的纯化方法:中国，CN1319984C［P］.2007－06－06.