HCV分型研究进展

李 媛，冯 悦，夏雪山，胡学伟

(昆明理工大学，昆明 650500)

目前丙型肝炎病毒(HCV)感染已成为世界性的公共卫生难题，威胁着人类健康。HCV全球感染人数接近1.7亿，且以每年新增300万的速度增长，具有流行面广、发病率高的特点，并与慢性肝病、肝硬化、肝癌等疾病密切相关［1］。该病毒自1989年首次鉴定以来，经过20多年的研究，对其病毒学等方面的特征已有了较深入的认识。HCV是单股正链的 RNA 病毒，基因组全长约为 9.6 kb［2］。目前，针对HCV通常使用的治疗方法是聚乙二醇干扰素-ɑ(Peg-IFN-ɑ，)联合利巴韦林(RBV)，但该方法并非对所有的丙型肝炎(丙肝)患者都有理想的疗效，其中，HCV的基因型及基因亚型是影响疗效的一个主要因素［1，3］。不同的HCV基因型或亚型对肝脏的损伤情况不同，对干扰素的敏感性也有差异，因而在疾病进程、治疗等方面不能从一而论。目前已发现的的 HCV 基因型有6 种，基因亚型 80 余种［4，5］，并且新的基因型和亚型仍在不断报道中［6～9］。本文现就目前HCV分型研究中常用的方法、分型区段作一综述。

1 HCV分型常用方法

目前HCV分型中常采用的方法有如下几类:多聚酶链式反应(PCR)及相关衍生方法、血清学方法、基因芯片法等。

1.1 PCR及相关衍生方法 PCR法因其能对微量核酸进行指数倍扩增，并最终获得检测结果，又具有相对快速、高效的特点，得到广泛应用。PCR依赖的序列分析法主要是通过对病毒基因组全长序列或部分序列的测定比对及分析，发现其不同特点，从而进行基因型或亚型的确定。在基本PCR方法的基础上，又衍生出了实时荧光定量 PCR(real-time PCR)、巢式PCR(nested-PCR)、限制性片段长度多态性(RFLP)等方法。

1.1.1 实时荧光定量PCR法 指在PCR反应体系中加入荧光标记物，通过对荧光信号的捕获实现对扩增过程的观察和监测的一种方法。荧光灵敏度好，效率高，能做定量分析，减少实验步骤，结果重现性好。郭新会等［10］研究认为实时荧光定量PCR在敏感性、特异性、重复性和便捷性等方面均优于直接测序法。但该方法需要专门的荧光定量PCR仪及配套试剂，实验成本较高。

1.1.2 巢式PCR法 巢式PCR是常规PCR的一种变异形式，其使用两对PCR引物扩增片段，第一对PCR引物扩增片段与普通PCR相似，第二对引物为巢式引物，结合在第一次PCR产物内，经历两个PCR程序，扩增特异性增强，灵敏度与可靠性优于普通PCR，常用于低浓度的核酸扩增。王晓忠等［11］用巢式PCR法结合其他方法分析了新疆地区少数民族静脉吸毒者中HCV感染者的病毒基因型，鉴定出HCV1型是该人群中的流行优势型别。

1.1.3 RFLP法 该方法通过提取及扩增靶基因，利用限制性酶切位点间的插入、缺失、重排、突变等原因而造成的基因型间限制性片段长度的变异，进行适当的酶切后从特异性的电泳图谱观察其多态性，借以区分不同基因型。在HCV分型检测中，RFLP法主要针对5'UTR区进行。邱国华等针对5'UTR区扩增后，采用 BHH'(BsrBⅠ、HaeⅡ、HinfⅠ)复合内切酶、BstUⅠ内切酶及HaeⅢ内切酶对93份HCV RNA的PCR产物依次进行酶切消化，完成了 HCV1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、6a 的鉴别，获得良好的分型效果［12，13］。因 5'UTR 区比较保守，故RFLP法敏感性较高，能同时鉴别出多个型别，减轻了工作量，适合于大规模的筛查。目前该法已能正确能检出HCV1～6型基因型，还能区分HCV1b、2a、2b、3a、3b 等亚型［1］。但 RFLP 法稳定性较差，重复性较低。

此外，还存在其他PCR衍生方法，但在HCV分型中应用较多且效果较好的主要为以上几类。实际操作中常常存在多种方法联合运用、相互验证的情况。如王敏等［14］联合荧光定量PCR法和巢式PCR法探讨了广州地区无偿献血人群HCV的基因型分布情况。

1.2 血清学方法 血清学方法是一种经典的病毒性疾病诊断方法，目前常用于HCV分型检测的为多肽ELISA、重组抗原ELISA等，它们的敏感性、准确性较高，经过对HCV RNA的C区、NS4区、NS5区等区段进行检测，已经能区分HCV1～6型，与PCR等分子生物学方法基因分型的相符率能达到95%以上［1］。陈青锋等［15］对168例样本进行血清分型和基因分型相关性的研究，发现二者的符合率可达96.7%。血清学方法快捷简便，成本低，临床应用广泛，但当出现病毒混合感染或病毒变异时难以区分。

1.3 基因芯片法 基因芯片是将大量特定的基因片段固定或附着于经过特殊处理的膜、玻片等支持物上，然后通过杂交、扫描、检测、分析等步骤，得到所需要的信息。目前利用基因芯片技术已能对HCV的6个基因型和10余个亚型成功进行分型［16］。毛红菊等［17］采用基因芯片法检测丙肝患者HCV的基因型，并通过测序结果进行验证，二者完全一致。基因芯片上可以排列大量不同类别的探针以满足不同需要，例如联合HCV的5'UTR区和C区可提高分辨力，扩大分型范围。运用基因芯片这一性质，有望同时对多种病毒进行检测分型。该法具有灵敏、高通量、集约化、规模化、结果准确等优点［17］，但因其技术要求高、制作复杂，在推广上还受到一些限制。

常用HCV分型方法的优缺点见表1。

表1 常用HCV分型方法的优缺点

2 HCV分型常用区段

HCV的分型方法有多种，分型的靶区段也有多个。HCV基因组由两端两个非编码区(UTR)和中间的一个开放阅读框(ORF)组成。ORF区又依次分为 C区、E1区、E2区、NS1区、NS2区、NS3区、NS4A区、NS4B区、NS5A区和NS5B区。两个UTR(即5'UTR和3'UTR)是HCV基因组中最保守的区域，而 E1 区和 E2 区则是变异率最高的区域［1，4，5］。其中NS5B区、C区、E1区是目前较常用的分型区段。

2.1 NS5B区 NS5B区位于HCV基因组7602～9371位点之间，是一段相对保守的区域。Martro等［18］通过解读NS5B片段信息，分析了3例来自于Barcelona地区的HCV样本，确定其为一种较为罕见的HCV亚型——2q亚型。万祥辉等［19］从 Genbank中筛选了多条信息完整、有注释的来自于不同国家和地区的HCV全基因组序列，在系统进化树重建原理基础上，对不同的区段分型效果进行比较，认为NS5B能代表HCV全基因组序列的情况，最能反映HCV毒株的演化关系，是分型的最佳区域。Murphy等［20］也曾展开NS5B区段的序列分析，认为通过NS5B区域的分析，能对HCV进行有效的基因分型。

2.2 C区 C区是指HCV基因组342～914位点间的片段，长度为573位点，是高度保守的区段。Simmonds等［21］研究了C区中15～384位点间的序列，认为基因型间的序列相似度为81% ～88%，而亚型的相似度在88% ～93%。Okamoto等［22］通过研究44个HCV样本的C区序列，划分出了4个HCV基因型。

2.3 E1区 E1区位于HCV基因组915～1490位点，长度为576位点，是HCV基因组内变异率最高的区域之一，其高变异率是HCV在感染者体内呈现准种分布的原因之一，也是HCV分型常用的靶区段。Simmonds等［21］曾对HCV基因型鉴定中NS-5、E1区的序列进行比对，发现E1区的分型结果与NS-5区在HCV的6个主要基因型和一系列亚型上十分吻合，认为E1区和NS-5区已包含了足够的系统信息来鉴定已知的HCV基因型或亚型。

NS5B区、C区、E1区及其他区段(如5'UTR)常被联合应用于HCV分型的检测［23］。Xia等联合NS5B区域和5'NCR-C区进行研究，在HCV/HIV-1共感染的静脉吸毒患者中，发现了HCV新的基因亚型和基因型的新分布［7］。

3 问题与展望

Simmond等曾对HCV分型情况做了总结，并对HCV基因型和基因亚型尤其是新基因型和新亚型的确定提出建议:新确立的基因型需要在现有基因型的分类基础上较恒定地保持独立性，应运用多种方法对编码区全序列及特定区域如C/E1/NS5B区进行系统分析，并确认病毒无重组发生;新亚型的提出需注重其流行病学意义，同一个基因型中的不同亚型，序列间差异需大于15%［4］。但在实际研究中，HCV的高变异率往往导致HCV的分型面临一些复杂局面，如Lu等的研究显示，在HCV6型中，有一些毒株在亚型内的遗传距离大于亚型间的遗传距离，这给分型判定带来了一定的困扰［8］。除了通过序列分析发现新的基因型、基因亚型外，药物治疗的无效位点也可能有助于发现新基因型［23］。未来有望通过建立病毒体外培养体系等方式，从分子机制上探索HCV不同基因型间的的感染差异和传播行为，最终为丙肝的控制、治疗等的研究和实践提供依据。

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