不同品种丁香叶中芦丁及丁香苦苷的含量测定

于淼1 孟繁颖1 苏瑞2赵宏博1崔培珅1方洪壮1

（1佳木斯大学药学院，黑龙江佳木斯154007；2哈尔滨市第一医院药剂科，黑龙江哈尔滨150010）

药用丁香叶为木樨科丁香属植物紫丁香（Syringa oblata Lindl.）、 朝 鲜 丁 香 （Syringa diatata Naka.）和洋丁香（Syringa vulgaris L.）的干燥叶[1]，具有广谱抗菌、抗病毒等作用，主要用于治疗肠炎、急性痢疾、黄疸型肝炎、乙型肝炎、结膜炎等[2-3]。常见的丁香属植物还有暴马丁香（Syringa reticulata（Blume）Hara.）、关东丁香（Syringa velutina Kom.）、小 叶 丁 香 （Syringa microphylla Diels.）、红 丁 香（Syringa villosa Vahl.）和什锦丁香（Syringa chinensis Willd.）等。丁香属植物中含有多种具有药用活性的化学成分[4-5]，其中芦丁具有清除自由基、抗脂质过氧化、舒张血管及影响药物代谢酶活性等作用[6-7]；丁香苦苷具有清除氧自由基、抗菌消炎、抗病毒、降压、降温、镇咳祛痰等作用[8]。为完善丁香叶药材的质量控制，探索扩展丁香叶的药用资源，本研究建立多波长同时测定丁香叶中芦丁及丁香苦苷含量的高效液相色谱法（HPLC），并对7个品种丁香叶进行了含量测定。在定量色谱峰的确认上，采用化学计量学中的光谱相关色谱法[9-11]，处理丁香叶 HPLC-二极管阵列检测器（DAD）的二维数据获取准确的定性信息。结果表明，所建立的HPLC法可用于丁香叶中芦丁及丁香苦苷的测定，方法准确可靠、灵敏度高；不同品种的丁香叶中都含有芦丁，芦丁及丁香苦苷含量在不同的丁香叶中均有较大的差异。

1 仪器与试药

Agilent 1200系列高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），包括G1311A四元泵，G1322真空脱气机，G1329自动进样器，G1315DAD检测器；BP211D电子天平（德国赛多利斯公司）。

芦丁对照品（天津一方科技有限公司，批号：20070824）；丁香苦苷对照品（上海顺勃生物工程技术有限公司，批号：20091009）；丁香叶样品为2010年7月采自哈尔滨植物园7种有分类标识的丁香树的树叶；流动相乙腈、甲醇为色谱纯；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）及保护柱（4.6 mm ×12.5 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸水（20∶80），流速 1.0 mL/min；定性分析时，检测波长为200～400 nm，波长间隔2 nm；芦丁定量分析检测波长为255 nm，丁香苦苷225 nm；柱温为室温；进样量10 μL；理论塔板数按芦丁峰计算不少于6 000，丁香叶中芦丁、丁香苦苷的色谱分离结果符合定量要求。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取经60℃减压干燥的丁香叶粉末约1.0 g（过60目筛），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇 50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失重量，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液。

2.2.2 对照品溶液的制备 取芦丁对照品和丁香苦苷对照品适量，精密称定，分别用甲醇制成每1 mL含0.25 mg的芦丁对照品储备液和每1 mL含1.25 mg的丁香苦苷对照品储备液。避光、冷藏。

2.3 色谱法定性

取供试品溶液及由芦丁、丁香苦苷对照品溶液制得的混合对照品溶液，分别按2.1项定性条件进行测定。不同品种丁香叶与对照品的225 nm和255 nm HPLC图见图1。由图1可知，芦丁和丁香苦苷对照品色谱峰的保留时间分别为6和17 min。提取对照品色谱峰处的200～400 nm的数据，作为标准光谱，分别计算其与不同品种丁香叶色谱保留时间部分区间二维数据中的光谱间的相关系数，并绘制相应的光谱相关色谱曲线[10]，确定用于定量的色谱峰。其中，紫丁香叶和什锦丁香叶中芦丁、丁香苦苷的光谱相关色谱曲线见图2。

图1 不同品种丁香叶中芦丁（1）、丁香苦苷（2）的255 nm 色谱图（A）与 225 nm 色谱图（B）

2.4 线性关系、检测限和定量限

图2 芦丁、丁香苦苷的光谱相关色谱曲线

精密量取芦丁、丁香苦苷对照品溶液各0.50、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分别置 10 mL 的不同量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，制成6个不同浓度的混合对照品溶液。按2.1项下定量色谱条件测定，每个浓度进样2次，取其峰面积平均值Y为纵坐标，进样量 X（μg）为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。芦丁和丁香苦苷分别在0.125 0～2.000 μg 和 0.625 0 ～ 10.000 μg 的 范围 内线 性关系良好，结果见表1。取芦丁、丁香苦苷对照品溶液，用甲醇逐步稀释成不同浓度的对照品溶液，分别进样10 μL，取信噪比S/N=3时的浓度为最低检测限，S/N=10时的浓度为最低定量限。芦丁、丁香苦苷的最低检测限和最低定量限见表1。

表1 丁香叶药材中芦丁、丁香苦苷的标准曲线、检测限和定量限

2.5 精密度试验

选取用于制备标准曲线中的3个不同浓度混合对照品溶液（含芦丁浓度分别为0.05、0.10、0.15 mg/mL；含丁香苦苷浓度分别为 0.25、0.50、0.75 mg/mL）。每个浓度连续进样 6次，记录芦丁和丁香苦苷色谱峰的峰面积值，以峰面积计算RSD（n=6）分别小于 0.49%、0.49%、0.48%和 0.42%、0.40%、0.41%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一份供试品溶液，分别于 0、2、4、6、8、12、24 h进样，记录色谱峰面积。结果芦丁峰面积的RSD为0.95%，丁香苦苷峰面积的RSD为0.35%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取紫丁香叶6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别在上述色谱条件下进行测定，记录峰面积，计算含量。结果样品中芦丁的RSD为1.6%；丁香苦苷的RSD为2.1%，表明该方法重复性良好。

2.8 回收率试验

取已知含有量的紫丁香叶粉末9份，各约0.1 g，精密称定，每3份为1组。每组按芦丁和丁香苦苷含有量的 120%、100%、80%3个目标质量，分别精密加入适量的芦丁和丁香苦苷的对照品溶液，按2.2项下方法平行制备成高、中、低3个浓度的供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，计算回收率。芦丁和丁香苦苷的平均回收率分别为99.9%和99.4%，RSD分别为1.4%和1.1%。

2.9 样品含量测定

取不同品种丁香叶粉末各3份，每份1 g，精密称定，按 2.2项下方法制成供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，用外标法测定计算芦丁和丁香苦苷的含量。结果见表2。

表2 不同品种丁香叶中芦丁和丁香苦苷的含量（mg/g，n=3）

由表2可知，7种丁香叶中芦丁和丁香苦苷的含有量均差异较大，其中，丁香苦苷的差别更为明显。7种丁香叶中均含有芦丁，以洋丁香、小叶丁香和什锦丁香的含量较高；丁香苦苷在紫丁香叶中含量最高，且在小叶丁香、关东丁香、暴马丁香和红丁香中未检测到。

3 讨论

3.1 色谱条件的选择上，比较了等度洗脱条件下的不同比例的甲醇-磷酸水、甲醇-乙腈-磷酸水及乙腈-磷酸水体系，结果以乙腈-磷酸水分离效果最佳；也比较了0.1%、0.2%和0.3%3个不同浓度的磷酸水，结果未见磷酸的浓度对分离结果有影响，故最终选定流动相为乙腈-0.1%磷酸水（20∶80）。另外，对供试品溶液及对照品溶液的芦丁和丁香苦苷色谱峰DAD检测结果表明，芦丁与丁香苦苷的紫外光谱的最大吸收分别为255 nm和225 nm。为增加方法的灵敏度，采用了多波长同时检测方法[12]，在255 nm测定芦丁，在225 nm测定丁香苦苷。

3.2 供试品溶液制备时，当提取溶液量（50 mL）不变，丁香叶粉末量分别为 0.1、0.5、1.0 g时，样品的提取率不受影响。基于此结果，回收率试验时，选用的样品量为0.1g而非通常的样品测定时的1/2量（0.5 g），以节省对照品的加入量。

3.3 丁香苦苷作为丁香叶药材的主要有效物质的文献报道较多，而未见丁香叶中芦丁含量测定的报道。本实验中曾对山梅花属植物西南丁香叶进行了测定，西南丁香叶中也含有芦丁，且含有量高于实验所涉及的7种丁香属植物。

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