银杏叶总黄酮对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

王远1 王海桃2

（1青岛市第九人民医院，山东 青岛 266002；2青岛市肿瘤医院，266042）

脑 梗 死 （cerebral infarction，CI）[1]又 称 缺 血 性脑卒中（cerebral ischemic stroke，CIS），是指局部脑组织因血液循环障碍，缺血、缺氧而发生的软化坏死。CI主要是由于供应脑部血液的动脉出现粥样硬化和血栓形成，使管腔狭窄甚至闭塞，导致局灶性急性脑供血不足而发病。CI具有发病率高、致残率高、预后差、易复发等特点，居脑血管病死亡原因之首。再灌注损伤可以使复流脑组织神经细胞坏死或凋亡加重，水肿明显，梗死面积扩大，并继发血管内皮细胞损伤及植物神经功能障碍。

银杏叶味甘、苦、涩，性平，有敛肺、平喘、活血化瘀、止痛功效。银杏叶总黄酮是一种天然中草药提取物，其中含有黄酮类、萜内酯类、少量的多酚类、生物碱、长链醇、酮类及微量元素等主要化学成分，其中银杏黄酮、银杏内酯类物质有拮抗血小板活化因子、抑制血小板聚集、扩张血管等作用[2]。本研究就银杏叶总黄酮对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其可能的作用机制进行了研究，为银杏叶总黄酮在治疗CI的医药领域提供理论依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

S-54紫外可见光分光光度计（上海棱光技术有限公司）；HH-SY11-Ni电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表有限公司）；GL-203Ⅱ离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW-80A微型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；光学显微镜（日本Olympus）。

1.2 材料和试剂

昆明种小鼠（泰山医学院实验动物中心提供），雌性，15～ 25 g；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成科技有限公司）；舒血宁注射液（国药准字Z11021351，北京双鹤高科天然药物有限责任公司）。

2 实验方法与结果

2.1 实验方法

2.1.1 动物分组与给药

小鼠随机分为5组，即对照组、模型组、银杏叶总黄酮高剂量组（20 mg/kg）、银杏叶总黄酮中剂量组（5 mg/kg）、银杏叶总黄酮低剂量组（1 mg/kg），每组8只。小鼠适应性喂养3 d后，银杏叶总黄酮注射液腹腔注射连续给药7 d。模型组和对照组在相同时间注射等量生理盐水。末次给药2 h后进行脑缺血再灌注手术。术后继续给药，48 h后取血测定SOD、MDA，取脑组织切片做苏木素-伊红（HE）染色。

2.1.2 动物模型的制备[3]

动物于术前12 h禁食，称重，按0.1 mL/10 g腹腔注射0.5%戊巴比妥钠麻醉。用医用胶带仰卧位固定小鼠，行颈部正中切口，分离双侧颈总动脉及伴行的迷走神经，从分离好的颈总动脉下方穿过一条丝线，将丝线提起，挂于铁架台上阻断血流，15 min后松线恢复脑血液循环，10 min后实行再灌注，重复3次，缝合颈部皮肤。术后将小鼠置于37℃恒温环境促其苏醒。术后及时供应水分及饲料。对照组仅分离双侧颈总动脉及伴行的迷走神经。

2.1.3 形态学指标测定

小鼠手术后48 h断头取脑，将脑组织固定在40%中性甲醛48 h后，流动水冲洗24 h，梯度酒精脱水，按常规方法进行石蜡包埋，切片依次入二甲苯脱蜡、梯度酒精复水，双蒸水洗2次，苏木精染色 8 min，1%盐酸酒精分色，碱性水蓝化，伊红10 min复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察并照相。

2.1.4 血清指标测定

小鼠术后48 h摘眼球取血于1.5 mL离心管中，4℃静置 24 h，3 000 r/min 离心 10 min，取上清按照各试剂盒说明书进行血清中SOD、MDA含量测定。

2.1.5 统计学处理

2.2 实验结果

2.2.1 银杏叶总黄酮对小鼠脑神经形态的影响

小鼠脑皮层区及海马区HE染色结果如图1、2所示：对照组脑神经细胞呈椭圆形，排列整齐，结构正常，核染色质稀疏，核仁清楚；模型组脑神经细胞数量明显下降，变性细胞数明显增多，可见许多神经细胞出现明显形状上的改变，细胞排列紊乱，结构模糊，细胞间隙增大，细胞体积缩小，胞浆浓缩，染色质凝集；与模型组相比，中剂量组明显减轻了神经细胞的变性。

2.2.2 银杏叶总黄酮对小鼠血清SOD、MDA的影响

图1 小鼠脑组织皮层区HE染色结果（×400）

图2 小鼠脑组织海马区HE染色结果

与对照组相比，模型组小鼠血清中的SOD活性下降，MDA含量增加；与模型组相比，银杏叶总黄酮则使小鼠血清中的SOD活性增强，并使MDA含量下降（见表1）。

表1 银杏叶总黄酮对小鼠血清中SOD和MDA影响（n=8，±s）

表1 银杏叶总黄酮对小鼠血清中SOD和MDA影响（n=8，±s）

注：*用药组与模型组比较，P＜0.05；Δ模型组与对照组比较，P＜0.05；**用药组与模型组比较，P＜0.01；Δ Δ模型组与对照组比较，P＜0.01

组别 剂量（mg/kg）SOD（U/mL）MDA（U/10mL）对照组 - 193.00±9.10 38.6±28.5模型组 - 166.98±20.87Δ 120.0±17.3ΔΔ低剂量组 1 167.66±26.33 96.2±14.8**中剂量组 5 196.23±19.68* 83.6±16.4**高剂量组 20 198.71±20.20* 68.4±15.2**

3 讨论

银杏是地球上存活最久的植物之一，银杏叶始载于《本草品汇精要》，作为祖国的传统中药已沿用数千年。银杏叶总黄酮具有广泛的生理活性，在中枢神经系统中具有调节脑能量代谢、保护神经元、增强记忆等功能。由于银杏叶的有效成分已基本确认，近年来出现了一些关于银杏叶的临床药理学及应用研究。

本实验通过对小鼠脑组织进行HE染色，研究发现脑缺血灌注的小鼠较正常小鼠相比，脑神经细胞数量明显下降，细胞结构破坏明显，而经银杏叶总黄酮预处理后，可以明显减轻脑神经细胞的受损程度，改善小鼠的CI情况，表明银杏叶总黄酮对CI具有一定的保护作用。

缺血性脑损伤是多种病理机制交互作用的结果[4]，在诸多损伤因素中，神经细胞能量衰竭被认为是首先发生的重要环节，脑组织缺血后能量代谢的异常，使线粒体内电子传递失调，致使氧分子接受单个电子生成氧自由基，同时黄嘌呤氧化酶（XO）系统被激活，XO在将三磷酸腺苷（ATP）的降解产物次黄嘌呤转化为黄嘌呤，并产生大量氧自由基，另外SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等自由基清除系统被大量消耗也造成缺血后脑组织自由基的堆积。自由基损伤的主要病理机制是脑缺血再灌注后，由于脑组织中富含脂质，极易受到氧自由基的攻击，膜脂质发生过氧化，破坏了膜脂质的代谢和结构，并生成了一系列脂质自由基及其降解产物MDA[5]。自由基也可直接氧化酶蛋白氨基酸残基，引起酶蛋白构象改变，使酶失活。

正常生物体内自由基生成与清除处于动态平衡[6]，脑缺血时，氧供应不足，大量的自由基生成，使脑内脂质过氧化作用加强，导致细胞及细胞屏障损害，神经元坏死或凋亡，引起和加重缺血脑组织水肿。再灌注恢复组织氧供应，也提供了大量电子受体，使氧自由基在短时间内爆发性增多。SOD为抗氧化酶，是体内主要的自由基清除剂，能催化超氧自由基发生歧化反应，清除体内超氧自由基，对维护细胞结构和功能完整，延缓细胞衰老发挥重要作用[7]。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，其活性可以间接反映机体清除自由基的能力，因此，可将SOD活性大小作为机体抗氧化能力的一项重要指标。本研究结果表明，脑缺血再灌注可使小鼠血清中SOD活性降低，而给予银杏叶总黄酮预处理后，可减轻这种损伤，提高血清中SOD活性[8]。

机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物[9]，如醛基（如MDA）、酮基、羟基、氢过氧基等。脂质过氧化作用不仅把活性氧转化为活性化学剂，即非自由基性的脂类分解产物，而且可通过链式或链式支链反应，放大活性氧的作用。因而测定MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度[10]。本研究结果表明，脑缺血再灌注可使小鼠血清中MDA含量升高，给予银杏叶总黄酮预处理后，可减轻脑缺血再灌注引起的损伤，降低MDA含量。

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[5]谭婷，陈鹏，王美纳.脑缺血再灌注损伤机制研究进展[J].中国行为医学科学，2005，20（3）：144-146.

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[10]乔玉成.老龄大鼠脑组织SOD/MDA与NO/NOS的相关性研究[J].中国体育科技，2009，45（2）：102-106.