E2弱化双酚A雌激素活性机制

张光明，郎 朗，李 钰，马 军

(1.哈尔滨工业大学 市政环境工程学院，150090哈尔滨;2.中国人民大学 环境学院，100872北京;3.哈尔滨商业大学生命与环境科学研究中心，150028哈尔滨;4.哈尔滨工业大学理学院，150001哈尔滨)

内分泌干扰物(EDCs)可致人体内分泌失调，引发多种疾病，还会对后代带来不良影响.双酚A是典型的雌激素类EDCs，可严重干扰内分泌系统，威胁着胎儿和儿童的健康.欧盟认为双酚A会诱发性早熟，从2011年3月2日起，禁止生产含双酚A的婴儿奶瓶.在我国北京、上海、深圳、杭州等大中城市饮用水水源中均发现了一定浓度的双酚A［1］，其雌激素活性的有效控制引起广泛关注.雌二醇(E2)是人体天然雌激素的代表物质.前期研究发现E2与双酚A共存时可以弱化双酚A的雌激素活性［2］.这一现象对于控制双酚A对人体尤其是女性的毒害作用具有重要意义.本文将深入研究这一现象发生的可能机制.

1 实验

所用乳腺癌MCF-7细胞为实验室自行培养.双酚A、E2、苯甲基磺酰氟(PMSF)、抑肽酶A、亮抑肽酶、色胺酸等购自美国Sigma公司.丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)购自美国Ameresco公司.其他材料为国产分析纯试剂.实验中双酚A、E2浓度分别为10-8、10-12mol/L.所用主要设备包括GeneAmp®PCR System 9700(Applied Biosystems公司)、DYY-6B电泳仪(北京市六一仪器厂)、蛋白质电泳及Western杂交转膜系统(Bio-Rad)、LSM Meta510激光共聚焦仪(Zeiss公司)、IGO 150二氧化碳培养箱(Thermo公司).

采用流式细胞仪法测定细胞周期的变化［3］.细胞增殖指数ⅠP=(nS+nG2)/(nG1+nS+nG2)×100%，nS为DNA合成期细胞数;nG1为第1间隙期细胞数;nG2为第2间隙期细胞数.

采用WESTERN BLOT法测定乳腺癌MCF-7细胞内雌激素受体α蛋白，以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路相关蛋白.该方法可检测到低至10～100 pg的环境雌激素的干扰效应［4］.蛋白样品制备、SDS-PAGE电泳、Lowry法测定蛋白含量、免疫反应、化学发光、显影、定影等均参照分子生物学蛋白检测方法［5］.以β-Tublin蛋白作为内参照，对目的蛋白表达量进行校正.

采用RT-PCR法测定EDCs干扰效应相关的转录因子C-fos、C-jun.步骤如下:细胞培养、RNA抽提、分离、沉淀、洗脱、再溶解、定量、逆转录(RT)、聚合酶链式反应、电泳鉴定［5］.

2 结果与讨论

2.1 对细胞周期的影响

细胞分裂复制的过程称为细胞周期.整个细胞周期被划分为G1→S→G2→M→G1，其中最具特征性的阶段是S期(DNA合成期)，经过短暂间隙(G2)，进入有丝分裂期(M期)，再经过短暂间隙(G1)，开始下一个周期.一旦调控系统发生故障，细胞就会过度增殖导致癌症［6］.

从表1可以看出，E2、双酚A及混合物均可改变MCF-7细胞周期，提高增殖指数ⅠP.E2使S期细胞比例由25.1%增加到34.2%，提高了9.1%，由于细胞在S期发生DNA合成，S期比例提高说明DNA合成增加.双酚A也可提高S期细胞比例，但效果较E2弱.而二者混合后，S期细胞提高比例进一步降低.此外，双酚A还可诱导G2期细胞比例增加5.4%，而E2则降低了G2期细胞比例1.3%.上述差异表明，E2与双酚A对MCF-7细胞的增殖机制不同.

表1 E2与双酚A联合作用于MCF-7细胞的周期变化%

2.2 蛋白表达

蛋白表达如图1所示.显然，空白组ERα蛋白表达良好，ERK系列蛋白表达较低，JNK系列蛋白与p38表达极弱，C-myc几乎不表达.各实验组的蛋白表达详细分析见下文.

图1 E2与双酚A联合对MCF-7细胞内蛋白表达的影响

2.3 雌激素受体蛋白表达

EDCs干扰内分泌系统的传统途径是与雌激素受体(ER)结合，从而使天然雌激素不能有效结合ER.在MCF-7细胞中最重要的ER是ERα蛋白［7］，因此，EDCs发挥雌激素活性主要是与ERα蛋白结合，使其不能正常表达，这是雌激素作用的经典路径［8］.图2所示为E2、双酚A、混合物对ERα蛋白的影响，E2对ERα蛋白的诱导能力最强、双酚A最弱、混合物介于二者之间.图2表明，E2、双酚A、混合物均可通过经典路径——雌激素受体途径发挥作用.

2.4MAPK信号转导通路研究

除了经典途径外，EDCs起作用的另一个重要途径是干扰MAPK信号转导通路.MAPKs(丝裂原活化蛋白激酶)是重要的信号传递者［9］，其种类众多，最重要的有胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)、p38等［10］.ERK1/2信号通路是经典的MAPK信号转导途径.活化的ERK1/2可磷酸化多种核转录因子，并诱导C-fos基因活化，增加C-fos蛋白合成［11］.

图2 E2与双酚A联合对MCF-7细胞ERα蛋白的影响

图3所示为E2、双酚A、混合物对MCF-7细胞内ERK蛋白表达的影响.E2显著提高了ERK蛋白的表达，双酚A基本没有影响，混合物效果略低于E2.图4所示为三者对活化后的ERK——p-ERK蛋白的影响.溶剂对照组p-ERK蛋白不表达，E2显著提高了p-ERK蛋白的表达量，而双酚A基本没有作用，混合物效果与E2相当［12］.图3、4均表明，双酚A对ERK信号通路没有作用.

图3 E2与双酚A联合对MCF-7细胞ERK蛋白的影响

图4 E2与双酚A联合对MCF-7细胞p-ERK蛋白的影响

图5所示为E2、双酚A、混合物对另一个重要MAPKs——JNK信号通路的影响.溶剂对照组JNK蛋白基本不表达，E2对其有一定增强作用，双酚A使其大量表达，而混合物对JNK蛋白表达的促进明显高于E2或双酚A.但由图1可以看出，JNK蛋白的活化形式——p-JNK蛋白在各种条件下表达量都较低，表明E2及BPA虽然刺激了JNK蛋白表达，但最终不能提高其活性，JNK通路并非其作用途径.

p38丝裂原活化蛋白激酶是MAPKs家族中的一员，调控应激情况下的细胞增殖和凋亡［13］.如图6所示，E2能够诱导p38蛋白的表达，而BPA使p38蛋白的表达量下降，两者混合后对p38的诱导介于两者之间.由于p-p38蛋白不表达，判断p38在E2、BPA及联合诱导增殖中不发挥作用.C-myc通过对靶基因的转录调节发挥其生物学效应［14］.如图7所示，溶剂组C-myc蛋白不表达，E2显著诱导其表达，双酚A对其没有影响，而混合物的诱导效应远远低于E2(0.092vs.0.017).如此显著的降低表明，E2与双酚A混合后，雌激素效应降低的主要机制是C-myc蛋白表达受到了抑制.

图5 E2与双酚A联合对MCF-7细胞JNK蛋白的影响

图6 E2与双酚A联合对MCF-7细胞p38蛋白的影响

图7 E2与双酚A联合对MCF-7细胞C-myc蛋白的影响

如图8所示，E2能够诱导C-fos基因的表达，双酚A对C-fos基因基本没有影响，两者联合后作用介于两者之间.如图9所示，E2、双酚A、混合物均可减弱C-jun基因的表达，混合物效应略强，但差别不大.

图8 E2与双酚A联合对MCF-7细胞C-fos基因的诱导

图9 E2与双酚A联合对MCF-7细胞C-jun基因的影响

如图10、11所示，E2、双酚A、混合物均可诱导Ki67蛋白的表达且混合物表现出增强效应.E2显著诱导cyclin D1蛋白表达，双酚A较E2弱很多，联合后E2使双酚A对cyclin D1蛋白的诱导增强.

图10 E2与双酚A联合对Ki67蛋白的影响

图11 E2与双酚A联合对cyclin D1蛋白的影响

3 结论

1)E2、双酚A、混合物都具有雌激素效应，可以促进MCF-7细胞的增殖.E2既可以通过经典途径(雌激素受体)起作用，又可以通过非经典途径(ERK信号通路)起作用.

2)E2可以促进C-myc基因与C-fos基因表达、诱导增殖蛋白Ki67与cyclin D1蛋白表达，增加DNA分裂期细胞比例，促进细胞增殖.而双酚A只通过雌激素受体途径起作用，激活cyclin D1蛋白.两者混合后，可通过受体途径及ERK途径发挥作用，促进C-fos基因的转录表达，促进Ki67蛋白表达.然而，C-myc蛋白显著下降，这可能是E2弱化双酚A雌激素效应的主要机制.

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