N2a细胞的-80℃冻存与复苏

童 飞 许家玉 彭 勇 曹永财

（安徽省芜湖市无为县动物疫病预防与控制中心，无为 238300）

N2a细胞全称mouse neuroblastoma N2a cells，也有人称其为Neuro-2a，是小鼠来源神经瘤母细胞。目前主要在实验室培养该细胞系作为体外病理研究的细胞模型。Neuro-2a是由R.J.Klebe和F.H.Ruddle经A株白鼠的自生肿瘤建立，该细胞贴壁良好，多数成神经元样，具有轴突样结构（图1）。通常N2a是放到液氮罐中长期保存的，并要定期给液氮罐补充液氮，这样保存的细胞系，复苏后生长状态良好，但成本较高，不适合那些充液氮不方便的地区使用。

图1 传代后2 d的N2a细胞

1 N2a细胞的培养

（1）配置高糖的Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM，GIBCO)培养基1 000 ml（pH=7.2～7.4）[1，3，4]。 ①1袋DMEM粉剂培养基用去离子水溶解；②加入NaHCO32.0g ；③加入谷氨酰胺0.146 g（终浓度为5 mM）；④加入青霉素10万U（终浓度100 u/ml），链霉素6.5万U（终浓度100 u/ml）；⑤定容900 ml；⑥过滤除菌、分装到2个消毒的500 ml蓝盖瓶中；⑦加入灭活10%胎牛血清（fetal bovine serum ，FBS ，GIBCO)100 ml。

（2）转代步骤。 ①弃原培养液用1 mlDMEM洗3遍；②用钝枪头吸取0.5ml胰酶（typsin，0.25%）+0.5mlDMEM消化2～3 min，轻摇1 min，镜下观察cell脱落、漂浮；③加1mlDMEM+10%fbs终止消化；④用钝枪头轻轻吸取培养液吹打，使cell完全散开；⑤将处理好的medium装入1.5ml的EP管中1000rpm离心，4min弃上清；⑥加0.5mlDMEM+10%fbs重悬cell，混匀cell；⑦取2个30mm的培养皿，各加入2片盖玻片，将细胞悬液在每片上滴1-2滴，再补全培养液至1/4皿高，转入37℃充满5%CO2培养箱中培养。

单层培养细胞在10%FBS-DMEM中能生长很好。一般来讲，1∶10传代后，1周可以长满。严禁过度生长，这点很重要。因为会导致细胞密度加大和堆积，传代时不易打散。N2a细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。

2 N2a细胞的-80℃冻存

正常细胞的冻存是按以下步骤进行。①配置冻存液：DMEM培养液∶FBS∶DMSO＝6∶3∶1( 注意：DMSO稀释过程中会产热，故切勿在细胞悬液中直接加入DMSO，可预先将FBS:DMSO按比例混好，等散热后，方可加入神经球悬液) 。②选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。老培养基吸出放到1.5mlEP管，1∶10(0.25%)胰酶消化2 min； 加入1ml 10% fbs中止消化； 0.5 ml老培养基吹吸细胞，吸入1.5 mlEP管，1000 r离心5min；轻轻倒掉上清，于4℃预冷15 min后，逐滴加入已无菌的含DMSO的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀， 按每冻存管约1.2×106冻存，每支1 ml；将装好细胞的冻存管装入沙布袋内，放入-20℃冰箱放置 2～4 h→放入 -80℃冰箱过夜 →再吊入液氮容器颈气态部分存放2 h，最后沉入液氮中长期保存。

-80℃冻存则将吊入液氮容器颈气态部分存放2 h和沉入液氮的骤省略，在某些地区由于经济和位置条件的限制很难及时地买到液氮，因而采用-80℃冰箱冻存细胞的方法显得格外的灵活适用。通过自己多次的冻存实验发现-80℃冰箱冻存细胞在1个月之内细胞的死亡率约＜45%，复苏后的细胞生长良好；2个月内细胞的死亡率约＞80%；3个月后细胞的死亡率为100%（图2）。所以我们可以采用-80℃冰箱短期反复地冻存来储存细胞系，当然此过程操作一定要规范，减少细胞污染的概率。

图2 不同时间复苏的N2a细胞

3 N2a细胞的-80℃复苏

按以下步骤：①带防冻手套从-80℃冰箱中取出冻存管，快速转入37℃水浴。（通常用保温瓶事先调好水温）10 min左右；②800～1000rpm×5min离心，移去冻存液，（可清洗1次）加入预温至37℃的新鲜培养液，适度吹打，种入1个100 mm培养皿；③第2 d分养或传代。复苏接种后24 h内，应尽量减少观察细胞次数或不作观察，以免因晃动而影响细胞贴壁。复苏后48 h左右观察贴壁情况并进行首次更换培养基比较合适，如果用1次性塑料培养瓶可增加细胞贴壁牢度。换液前宜将培养基预热。

经过多次实验验证可知，-80℃冰箱是可以短期冻存（1个月以内）N2a细胞系。-80℃冰箱冻存样品灵活方便、经济实惠、易于操作，尤其是那些比较偏远的地区，要克服购买液氮的困难，充分利用-80℃冰箱来保存细胞系和牲畜精液，为实现农业科技创新和基础性农业实验研究做出贡献。

[1]D.L.斯佩克特，R.D.戈德曼，L.A.莱茵万德.细胞实验指南.北京：科学出版社，2001.1～188

[2]J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔.分子克隆实验指南（第三版）. 北京：科学出版社，2002.1595～1560

[3]Minoru Sakaguchi， Kouichi Murayama， Kozue Yabe，et al.β-Casomorphin-5 stimulates neurite outgrowth in a mouse neuroblastoma cell line (Neuro-2a). Neuroscience Letters，1998. （251）:97-100

[4]Kimberly A. Petro Cara-Lynne Schengrund. Membrane Raft disruption promotes axonogenesis in N2a neuroblastoma cells. Neurochem Res ，2009.34（9）:29-37