NGF对神经干细胞内 Mash1表达的影响

王克健,孙光涛,黄昕艳

(1.佳木斯大学附属第一医院神经内四科,黑龙江佳木斯 154003;2.佳木斯大学附属第二医院神经内科,黑龙江佳木斯 154002)

现已证实 ,神经生长因子 (Nerve Growth Factor,NGF)能够促进 N SCs向胆碱能神经元定向分化[1],是目前已知效应最强的促 NSCs向胆碱能神经元分化的因子。但是其作用效果仍不理想,胆碱能神经元分化比率仍很低。碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-1oop-helix,bHLH)是一类十分重要的转录调节子家族,既往研究结果发现该家族在中枢神经组织表现的特别明显。按功能分为抑制型和激活型,两者处于动态平衡状态,共同来调控神经干细胞的分化,广泛地参与了神经系统的发生[2]。Mashl基因则是其家族的激活型基因,在 NSCs增殖、分化的过程中起着十分重要的调节作用。Mash1于前脑腹侧区域在胆碱能神经元内特异性的表达,并参与不同神经元亚型的形成。这些现象提示,NGF可能通过诱导 Mash1的表达以完成对 NSCs向胆碱能神经元定向分化的促进作用。

1 材料与方法

1.1 材料

RT-PCR试剂盒购自大连宝生物;DL2000 Marker购自上海生物工程公司;低熔点琼脂糖购自 MarescoARESCO公司;神经干细胞为佳木斯大学神经科学研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 NSCs分化诱导:取传至第三代的 N SCs,吹打成单细胞悬液,加入含不同浓度 NGF的神经干细胞分化培养基(分别为空白对照组,NGF50mg/L组,NGF100mg/L组,NGF200mg/L组)进行分化诱导,37℃,80%湿度,5%CO2的条件下培养箱中培养 7d后提取总 RN A。

1.2.2 Mash1基因 mRN A表达的检测:使用 RT-PCR方法检测分化诱导后神经干细胞 Mash1mRN A的含量,提取总 RNA,取 1μL RNA反转录制备 cDN A,然后取 1μL cDNA进行 PCR检测。根据 GenBank的 M 95603.1基因序列(小鼠Mash1的基因序列),采用 Primer-Premier5.0软件设计出其引物,Mash1基因的上游引物序列:5’-GGA AGA TCT ATG GAG AGC TCT GGC AAG ATG-3’下游引物:5’-CCC AAG CTT GTCA GAA CCA GT T GGT AAA GTC-3’;β-actin上游引物:5’-CAT CCG TAA AGA CCT CTA TGC CAAC-3’下游引物 5’-ATG GAG CCA CCG ATC CACA-3’。PCR反应体系为:去离子水 67.5 μL;上游引物Mash1/β-actin 2 μL;下游 引物 Mash1/β -actin 2μL;Tap聚合酶 0.5 μL;10X PCR Buffer 10 μL;dN TP Mixture 8μL;模板DN A10μL;加水补足至 20μL。反应条件:94℃ 30s;59℃ 30s;72℃ 45s,其中 Mash1重复 35个循环 ,β-actin重复 18个循环。

1.2.3 电泳鉴定及其结果观察分析:使用1%琼脂糖凝胶电泳,稳定电压120毫伏 ,电泳30min。应用凝胶成像分析系统扫描凝胶,测定电泳后各条带的积分光密度值(OD),以 Mash1的 OD值与 β-actin的 OD值的比值作为 Mash1的 mRN A相对表达水平。

1.3 统计学分析

所得数据应用 SPSS10.0行方差分析 ,组间比较采用t检验。P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

不同实验组提取总 RN A进行 Mash1基因的 RT-PCR反应电泳结果显示:各实验组均有 Mash1表达。其中空白对照组表达最少,以 NGF100mg/L组表达量最高 (图1)。针对Mash1与内参积分光密度值的比值,所得数据行方差分析示:具有统计学意义 (P＜0.05)(表1)。

图1 Mash1电泳图谱

表1 不同浓度 N GF对 Mash1表达的光密度的比较 (±s,n=3)

表1 不同浓度 N GF对 Mash1表达的光密度的比较 (±s,n=3)

单因素方差分析,与对照组比较*P ＜0.05,#P＜0.01。

组别 光密度比值对照组 30.7142± 0.0257 50mg/L组 30.7723± 0.0212*100mg/L组 30.9423± 0.0218#200mg/L组 30.8185± 0.0265#

3 讨论

近年来,神经干细胞的发现和体外分离培养的成功为治疗中枢神经系统退行性疾病提供了一个新的途径、方法和手段。在神经细胞生长过程中,N GF经由 NGF-RAS-M APK信号通路促进细胞分裂、引导神经纤维趋化性生长、诱导轴突生长、形成突触网络。NGF与其高亲和力受体 TrkA(tyrsine kinase receptor A)结合,激活 TrkA的自身磷酸化。磷酸化的 TrkA识别 Src(Steroid receptor coactiveator)同源结构域 2(SH2),并使其磷酸化。Shc(Src homologue and collagen protein)作为衔接蛋白(adapter protein)促使 Grb2通过自身SH3区与 GTP-GDP交换因子 Sos(Son of sevenless)结合。形成 TrkA-Shc-Grb2-Sos复合物并转移到质膜,结合在膜内表面的原癌基因产物 Ras并将其活化。其后,被活化的Ras进一步激活苏氨酸-丝氨酸蛋白激酶 Raf,磷酸化的 Raf又使双特异蛋白激酶 M EK磷酸化,进而激活丝裂原激活的蛋白激酶(mittogen-activated protein kinases,MAPK,又名胞外信号调节蛋白激酶)。M APK转位到细胞核,启动立早基因 (Immediate Early Gene,IEG)和延迟反应基因(delayed response gene,DRG)的转录,对基因表达、代谢及功能进行调控。

Mash1属于 bHLH家族中转录激活因子,它在染色体上定位在 12q22-q23,其由696个碱基表达的含有232个亚基的蛋白质组成,其中包括一个含有236个氨基的能与启动子 E-BOX(CACCTG)特异性相结合的 HLH结构域[3]。有研究表明 Mash1的高表达仅仅局限在正在发育中的中枢神经系统和周围神经系统中,Mash1在神经的生成、神经细胞的发育以及神经干细胞的分化过程中都起到巨大的正性调节作用,可以使神经干细胞具有向神经元方向分化的趋势,并与同基因家族其他的正负性调节基因互相交叉共同起作用一起调节神经组织的发生发展,从而决定了细胞的发展情况[4]。Mashl基因参与 NSCs向神经元方向分化的启动过程,同时也参与不同神经细胞亚型的形成。有研究表明,Mash1的高表达与 NSCs的分化过程相统一,Mash1在前脑腹侧区于 GABA能神经元和胆碱能神经元内特异性的表达[5]。

本实验通过 RT-PCR技术研究 NGF对神经干细胞内Mash1表达的影响,电泳结果显示:NGF能够促进 NSCs内Mash1基因的表达并提示 NGF促进 NSCs向胆碱能神经元定向分化的潜在机制可能是通过促进 Mash1的表达而完成的。但是在 N GF信号通路里 ,Mash1具体扮演何种角色仍不清楚,Mash1确切的下游基因尚不确定,其下游复杂的基因环路有待我们进一步研究。

[1]刘佳梅,陈东,孟晓婷.神经生长因子诱导神经干细胞向胆碱能神经元的分化 [J].神经解剖学杂志,2005,21(6):603-606

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[3]Franco del Amo F,Gendron- Maguire M,Swiatek PJ,et al.Cloning,sequencing and expression of the mouse mammalian achaete-scute homolog1(M ASH1)[J].Biochim Biophys Acta,1993,1171(3):323-327

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