缺血后处理对局灶性脑缺血再灌注大鼠 Bcl-xl、Bax的影响

贾丽娜,宋 友

(1.佳木斯市中心医院神经内二科,黑龙江 佳木斯 154002;2.佳木斯大学附属第一医院神经内一科,黑龙江 佳木斯 154003)

脑血管疾病有几个主要的特点,即发病率高、致残率高、复发率高、死亡率高。据国外统计资料,脑血管疾病以缺血性为多见 ,约占75%～90%,因此,对缺血性脑血管病的研究也尤为重要。研究发现,脑梗死后超早期恢复脑血流供应,即溶栓治疗,是减少半暗带,促进神经功能康复的最佳方案,通常临床医师会主张在这一时段行溶栓治疗,但大量报道也显示了血液再灌注对脑组织的损害,即脑缺血再灌注损伤。因此,如何减少脑缺血再灌注损伤,是众多学者面临的问题。近几年,人们发现缺血后处理是一种减少脑缺血再灌注损伤的方法,但具体的作用机制还不十分清楚。本实验通过观察缺血后处理对局灶性脑缺血再灌注大鼠 Bcl-xl、Bax的影响,揭示缺血后处理减少脑缺血再灌注损伤的作用机制,为脑梗死寻找一条更有效的溶栓方法。

1 材料与方法

1.1 动物及实验分组

成年 雄性 Wistar大鼠 144只,体重 250～ 300g,随机 分成三组 ,其中假手术组48只,对照组(脑缺血再灌注组)48只,缺血后处理组48只。

1.2 局灶性脑缺血再灌注模型的建立

采用大脑中动脉栓线法:用10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉。取颈部正中稍右0.5cm作切口,切开皮肤皮下组织,分离颈总动脉(CCA)、颈内动脉 (ICA)、颈外动脉(ECA),结扎颈总动脉近心端,用小血管夹夹住颈总动脉远心端(颈总动脉结扎处与上血管夹处保持5mm左右距离),在此处放置一打好结的备用丝线,勿收紧丝线 ,在此丝线下端剪一小口,插入已制备好的栓线头端 ,收紧线结,松去血管夹,在近颈总动脉分叉处用眼科镊暂时夹闭颈外动脉,将栓线经颈总动脉、颈内动脉送至颅内,入线深度由分叉部算约18～ 19mm,收紧备线,外留1cm线头,缝合皮肤。需再灌注时轻轻提拉所留线头至有阻力时表明鱼线头端已至颈总动脉切口处,则再灌注模型建立。

1.3 假手术组、脑缺血再灌注组及缺血后处理组大鼠的制备

假手术组:手术过程同缺血再灌注组,但仅暴露颈总动脉分叉处,不插线阻断大脑中动脉。对照组(缺血再灌注组):大脑中动脉线栓阻闭 90min。缺血后处理组:大脑中动脉线栓阻闭90min后 ,将鱼线略拔出,再灌注30s,再将鱼线置入初始位置,缺血30s,反复3次。各组大鼠分别再灌注12h、24h、48h、72h后进行相应指标的检测。

1.4 免疫组织化学法测定 Bcl-xl、Bax蛋白的表达

采用链酶亲和素—生物素复合物(SABC)免疫组化染色方法:用过量4%戊巴比妥钠麻醉,经升主动脉生理盐水(37℃)灌注至血液变清,用含4%多聚甲醛的0.1mol/L PBS(pH7.4,4℃)缓冲液200mL灌流固定,断头取脑 ,置于上述固定液中固定24h,取以视交叉为中心相当于前联合连续脑片,再常规脱水浸蜡制成石蜡切片。①切片常规脱蜡置水。②3%H2O2室温孵育20min,抑制内源性过氧化酶,0.01mol/LPBS(pH7.4)洗 3次 ,每次 3min。③切片浸入 0.01枸橼酸盐缓冲液(pH6.0),微波炉加热至98℃进行抗原修复,间隔 5min再进行一次,自然冷却后 PBS洗3次,每次3min。④滴加山羊血清封闭液 20min,封闭非特异性背景,倾去多余液体,不洗。⑤滴加 1:100的 Bcl-xl、Bax抗体,放入4℃冰箱中过夜,PBS洗3次,每次3min。⑥滴加生物素化羊抗兔 IgG即用液,37℃温箱孵育 20min,PBS洗3次,每次 3min。⑦滴加辣根标记的链酶亲和素,37℃温箱孵育20min,PBS洗3次,每次3min。⑧DAB显色,镜下控制反应时间,双氧水终止反应,一般为 8～10min,苏木素轻度复染 (1min),脱水,透明,封片 ,显微镜下观察。

1.5 结果判定

Bcl-xl蛋白、Bax蛋白阳性细胞均为胞浆呈棕褐色,以阳性细胞数 /10× 40高倍视野表示。每只动物随机取 2张切片,每张切片缺血侧随机观察5个视野。

1.6 统计学处理

2 结果

局灶性脑缺血后进行再灌注,缺血再灌注组与假手术组相比,各时间点 Bcl-xl蛋白表达明显降低,Bax蛋白表达明显增高,差异具有显著性 (P ＜0.01)。若在局灶性脑缺血后再灌注前进行后处理,Bcl-xl蛋白在缺血后处理组的表达24h达高峰,且缺血后处理组 Bcl-xl蛋白的表达在各时间点明显高于缺血再灌注组 (P＜0.01);而 Bax蛋白无论缺血后处理组和缺血再灌注组其表达高峰均在24h,但缺血后处理组 Bax蛋白的表达在各时间点明显低于缺血再灌注组(P ＜ 0.01)见表1(图 1,2)。

表1 各组大鼠脑组织 Bcl-xl蛋白、Bax蛋白表达变化(±s,n=6)

表1 各组大鼠脑组织 Bcl-xl蛋白、Bax蛋白表达变化(±s,n=6)

注:A组为假手术组,B组为缺血再灌注组,C组为缺血后处理组。*与假手术组比较 P＜0.01;△ 与缺血再灌注组比较 P＜0.01。

组别 12h 24h 48h 72h Bcl-xl A组 5.6± 1.8 6.1± 1.6 5.4± 0.8 5.3± 0.9 B组 2.4± 1.3* 3.9± 0.4* 3.7± 0.7* 2.8± 0.5*C组 10.5± 1.8△* 46.2± 8.4△* 26.6± 7.5△* 11.3± 3.5△*Bax A组 1.8± 0.9 2.5± 0.7 2.3± 1.0 1.9± 0.4 B组 18.7± 3.8* 36.3± 5.9* 22.5± 3.6* 16.2± 1.7*C组 5.1± 1.7△* 21.9± 3.4△* 11.4± 2.7△* 10.5± 1.8△*

图1 对照组24h Bcl-xl蛋白表达(×400)对照组48h Bcl-x l蛋白表达(×400)

缺血后处理组24h Bcl-xl蛋白表达(×400)缺血后处理组48h Bcl-xl蛋白表达(×400)

图2 对照组 24h Bax蛋白表达(×400) 对照组48h Bax蛋白表达(×400)

缺血后处理组24h Bax蛋白表达(×400)缺血后处理组48h Bax蛋白表达(×400)

3 讨论

脑缺血后处理(brain ischemic postconditioning,BIPC)是指脑缺血后、在长时间的再灌注之前,进行的数次短暂再灌注 /缺血的循环[1]。2003年发现缺血后处理可以减少缺血再灌注损伤以来,受到了人们的广泛关注。许多学者认为缺血后处理是机体另一种内源性抗再灌注损伤的保护措施,其减少脑缺血再灌注损伤的作用机制与其抗凋亡作用有关,但具体情况尚在研究阶段。

Bcl-xl是脑缺血导致的神经元凋亡的过程中抗凋亡的重要物质。大量学者研究发现,脑缺血再灌注后,发挥主要抗凋亡作用的蛋白是 Bcl- xl蛋白而非 Bcl-2。Merry等的研究提示,Bcl-xl具有结合凋亡蛋白酶激活因子-1而阻止凋亡小体形成的作用,因此 Bcl-xl的高表达可抑制线粒体介导的凋亡[2]。上述实验结果证实在因脑缺血导致的神经元凋亡的过程中 Bcl-xl蛋白具有重要的作用。与 Bcl-xl同属一个基因家族的 Bax作用却与 Bcl-xl截然不同,全脑缺血后,BaxmRNA与蛋白质主要在神经元死亡最严重的 CA1区表达且发生在迟发性细胞凋亡前,而在缺血损伤的非敏感区CA3区却无表达。CA1区 Bax的选择性表达表明:通过独立机制或与 Bcl-2家族其它成员形成杂二聚体机制,Bax参与了调控 CA1区神经元在脑缺血后的凋亡[3]。Bax可能对脑缺血后迟发性神经元死亡起促进作用[4]。另有研究显示 ,Bax与线粒体膜上的 Bcl-2和 Bcl-xl结合,减弱其凋亡抑制作用[5]。本实验结果显示:局灶性脑缺血后再灌注前进行后处理,缺血后处理组各时间点 Bcl-xl蛋白的表达明显高于缺血再灌注组,Bax蛋白表达明显低于缺血再灌注组。提示脑缺血后处理可以减少脑缺血再灌注后神经细胞的凋亡,缺血后处理减少脑缺血再灌注损伤的机制与其减少细胞凋亡的作用有关,这与 Zhao[6]等对脑缺血后处理后凋亡标记物的检测结果相符。

缺血预处理是在脑缺血之前给予的数次短暂再灌注/缺血的循环,临床上,可操作性较低;而缺血后处理是在脑缺血发生后再灌注之前进行,临床上可在脑梗死后溶栓之前操作,这克服了缺血预处理的弊端。故对缺血后处理的研究,特别是其具体操作的研究,有着重要而深远的意义。

[1]贾丽娜,宋友,程洪斌.缺血后处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注大鼠 SOD、MDA的影响 [J].航空航天医学杂志,2011,25(9):1049-1051

[2]Merry DE,Korsmeyer SJ.Bcl-2 g ene family in the nervous system[J].Annu Rev Neurosci,1997,20:245-267

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[5]Ferrer I,Planas AM.Signaling of cell survival following focal cerebral ischemia:life and death struggle in the penumbra[J].J Neuropathol Ex p Neurol,2003,62:329-339

[6]Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,et a1.Inhibition of myocardialinjury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285(2):579-588