灵杞黄斑颗粒中阿魏酸含量测定*

周永其，胡道德，刘亮，陈文娟

(1.江苏省太仓市第一人民医院药剂科，215400;2.上海交通大学附属第一人民医院临床药学研究室，200080)

灵杞黄斑颗粒为医院制剂(批准文号:沪药制字Z05050795)，由当归、肉苁蓉、菟丝子等中药材组方而成，具有补肾温阳、益气健脾、活血生精、通络明目之功效，临床主要用于治疗年龄相关性黄斑变性疾病。阿魏酸为当归的主要有效成分之一[1-2]，不仅能对抗氧自由基，使超氧自由基、羟自由基和过氧化氢等生成减少，而且还能与膜磷脂酰醇胺结合，使膜磷脂不受氧自由基的侵袭，从而发挥抗脂质过氧化作用[3]。年龄相关性黄斑变性疾病可能与氧化应激有关[4]。研究显示，该颗粒剂可能是通过清除自由基抗氧化和抗凋亡而发挥作用[5]。因此，对处方中阿魏酸进行定量，对有效控制和提高灵杞黄斑颗粒的质量具有重要意义。笔者在本实验中参考相关文献[6-7]，采用反相高效液相色谱法，对制剂中阿魏酸进行含量测定，拟建立一种简便、快速、准确、灵敏度高、专属性强的含量测定方法，为灵杞黄斑颗粒剂质量标准提供有价值的参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器Agilent 1100型高效液相色谱仪(四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、Chemstation色谱工作站)，Mettler Toledo AL-104电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，超声波清洗器(必能信超声有限公司)，HP-01真空过滤装置(天津市津腾实验设备有限公司)，5415D高速离心机(德国Eppendorf公司)，W2010数控恒温水浴锅(上海申胜生物技术有限公司)。

1.2 试药灵杞黄斑颗粒(委托上海练塘中药厂生产，批号:20100901，20100902，20100903，规格:每袋15 g)，阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110773-200611)，甲醇(美国天地公司，色谱纯，批号:807902)。其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为进样0～3 min，调节流动相A∶B(10∶90);3～20 min，流动相A∶B(36∶64);20～22 min，流动相A∶B(10∶90);流速:1.0 mL·min－1;检测波长:316 nm;柱温:30℃;进样量:10 μL。理论板数按阿魏酸计算不低于20 000。

2.2 对照品溶液的制备精密称取真空干燥至恒重的阿魏酸对照品适量，加甲醇溶解，制成5.794 mg·mL－1对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备取本品2袋，研成细粉，精密称定15 g，置具塞锥形瓶，精密加入80%甲醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液30 mL，置烧瓶，挥去溶剂，精密加入纯化水20 mL溶解，置分液漏斗，用乙醚50 mL分3次提取(每次分别加20，20，10 mL)，合并乙醚提取液，置烧瓶中蒸干，残渣用甲醇溶解，移至10 mL量瓶，并稀释至刻度，摇匀，用孔径0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备按处方比例及制法制备缺当归药材的阴性对照品，按“2.3”项方法制得阴性对照溶液。

2.5 方法专属性考察在本实验色谱条件下，分别吸取阴性对照溶液、对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定。结果对照品、供试品溶液色谱中阿魏酸峰均达到基线分离，阴性对照溶液色谱中无相应吸收峰，表明处方中其他成分对测定阿魏酸无干扰。

2.6 线性关系考察精密吸取阿魏酸对照品储备液，用甲醇分别制成0.058，0.116，0.232，0.348，0.464，0.579 mg·mL－1溶液，按上述色谱条件各进样10 μL，测定峰面积。以阿魏酸质量浓度(ρ，mg·mL－1)为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得阿魏酸标准曲线的回归方程:Y=4 443.6ρ－10.135(r=0.999 6，n=6)。表明阿魏酸在0.058～0.579 mg·mL－1范围内与峰面积值呈良好的线性关系。

2.7 检出限按上述色谱条件测定，得阿魏酸的检出限浓度为1.53 μg·mL－1(S/N=3)，定量限浓度为4.67 μg·mL－1(S/N=10)。

2.8 精密度实验精密吸取同一阿魏酸对照品溶液，连续进样5次，每次进样10 μL。记录阿魏酸色谱峰面积值，RSD为0.27%(n=5)，表明精密度良好。

2.9 稳定性实验精密吸取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h进样10 μL，记录色谱峰面积值，RSD为1.08%(n=6)，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.10 重复性实验取同一批样品(批号:20100901)5份，按供试品溶液制备方法平行制备样品溶液，进样，记录色谱峰面积值，代入线性回归方程得样品中阿魏酸的平均含量为0.212 mg·g－1，RSD为1.76%(n=5)，实验结果表明，该方法重复性较好。

2.11 加样回收率实验精密称取9份已知含量的样品(批号:20100901)各15 g，分别精密加入一定量的阿魏酸对照品，按供试品溶液制备方法分别制得高、中、低浓度供试品溶液，进样，记录色谱峰面积值。代入线性回归方程，外标法定量，得阿魏酸加样回收率为97.9%～101.5%，结果见表1。

2.12 样品含量测定取灵杞黄斑颗粒样品3批(批号:20100901，20100902，20100903)，每批平行测定3份，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，进样10 μL，记录色谱峰面积值，代入线性回归方程，测得3批样品中阿魏酸平均含量分别为0.210，0.216，0.211 mg·g－1。

3 讨论

灵杞黄斑颗粒由多味中药材组成，成分多，相互干扰较大，笔者分别比较了甲醇、甲醇水溶液和水等不同溶剂直接超声提取样品，发现杂质峰较多，经过多次实验发现经80%甲醇溶液超声处理30 min后，用乙醚进一步萃取样品中阿魏酸提取效果最佳。

表1 阿魏酸加样回收率实验结果mg

在流动相的选择中，由于阿魏酸是弱酸，用弱酸性流动相可抑制其电离，使色谱峰峰形稳定，分离度好。笔者分别考察了甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸溶液等各种比例的流动相，发现甲醇-0.1%磷酸水溶液(20∶80)洗脱时，阿魏酸能与其他组分较好分离，但阿魏酸的出峰时间很长，且样品溶液中水溶性杂质出峰时间冗长。为了缩短阿魏酸的出峰时间和避免水溶性杂质峰的干扰，本实验采用高效液相梯度洗脱程序对阿魏酸进行定量，通过选择在进样前3 min，保持甲醇在流动相中的比例为10%，达到促使水溶性杂质较快出峰的目的。

本研究参考相关文献[6-7]，采用甲醇-0.1%磷酸水溶液二元梯度洗脱程序对样品中有效成分进行分离、定量，并对洗脱条件进行了优化，获得了满意的结果。同文献[8-9]比较，缩短了分析周期，提高了分离效果，改善了峰形拖尾，增加了检测器灵敏度，同时还减少了程序进样时基线波动。样品含量测定结果表明，3批样品中阿魏酸的含量差异不大。

该测定方法专属性强，精密度和准确度高，稳定可靠，可用于灵杞黄斑颗粒中阿魏酸的含量测定，为建立灵杞黄斑颗粒质量标准的提供了参考。

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