丙泊酚对脑缺血-再灌注大鼠认知功能障碍与皮质TrkB/Akt通路的影响

张俊峰，周武，王涛

(1.湖北省新华医院麻醉科，武汉430015;2.华中科技大学同济医学院药学院，武汉430030)

缺血性脑血管病引起的学习记忆功能减退，不仅降低患者生活质量，威胁人类健康，而且给家庭和社会造成巨大的负担。丙泊酚(propofol，Pro)是一种抗氧化药，能拮抗活性氧导致的多种细胞损伤，具有一定的脑保护作用[1-2]。但其是否能抑制脑缺血-再灌注所致认知功能障碍尚未可知。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)对缺血低氧性神经元具有良好保护作用，TrkB是NGF的高亲和力受体，介导中枢神经元NGF依赖性细胞存活和分化[3-4]。笔者在本实验中探讨Pro对脑缺血-再灌注所致认知功能障碍的影响，及其对TrkB/Akt通路的作用，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料成年雄性SD大鼠，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心，体质量250～280 g。Pro标准品(德国费森尤斯公司惠赠，批号:J20040122)。DCS-2程控穿梭箱(中国医学科学院药物研究所产品)，MG-2Y型迷宫测试仪(江苏省张家港市生物医学仪器厂产品)。TrkB、p-Akt单克隆抗体购于Santa Cruz公司，其余试剂均为分析纯。

1.2 脑缺血-再灌注模型的制备与分组将大鼠随机分为4组，每组6只:假手术组(腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液)，缺血-再灌注组(模型组，腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液)，缺血-再灌注+Pro低、高剂量组(Pro分别为50和100 mg·kg－1，于缺血-再灌注开始前腹腔注射)。大鼠缺血-再灌注模型的制备采用改良的LONGA法[5]，以10%水合氯醛300 mg·kg－1腹腔注射麻醉，颈部正中切口，结扎左侧颈外动脉远端，热凝其分支，颈总动脉及颈内动脉置动脉夹，断开颈外动脉后插入远端涂有硅胶、直径0.24～0.26 mm的强力渔线，深度为距颈总动脉分叉处(18.0±0.5)mm，缝合皮肤。90 min后，拉渔线至颈外动脉残端，血流再通。假手术组除插线外，其他步骤同模型组。

1.3 避暗实验实验第1天为训练时间，将大鼠头朝外放入避暗箱明室，大鼠会因趋暗的习性进入暗室，受到电击1或2次而产生记忆。如大鼠不进入，则将其驱入暗室，使之产生记忆。第2天为测试时间，记录大鼠从放入明室至首次进入暗室并遭电击的时间，即进入暗室前的潜伏期和240 s内进入暗室的错误次数。

1.4 Y型迷宫实验将受试大鼠放入Y型迷宫内适应环境3 min，然后给予电刺激，设定电击电压50 V，延迟时间5 s。随机改变电击区和安全区，大鼠遭遇电击时直接逃避至安全区为正确反应，否则为错误反应。每电击10次后休息5 min。学习成绩以达到连续10次电击中有9次正确反应(90%正确反应)前所受的累计电击次数来表示。24 h后测定连续10次电击中正确反应次数，作为记忆成绩。

1.5 免疫组织化学再灌注后24 h，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸经左心室行主动脉插管，剪开右心房，以37℃0.9%氯化钠溶液快速冲洗，再灌注预冷的4%多聚甲醛固定液。断头取脑后将组织固定于4%多聚甲醛固定液中6 h，再入25%蔗糖磷酸盐缓冲液4℃过夜。待组织块沉底后，恒冷箱冰冻切片机切片(厚20 μm)，用漂片法制作。生物素复合物(strejptavidin biotin complex，SABC)法检测TrkB、p-Akt的表达。细胞质被染成棕黄色为阳性细胞。

1.6 Western Blot缺血-再灌注24 h后断头取脑，快速剥离缺血皮质，按照1∶9(W/V)加入裂解缓冲液，4℃匀浆，冰上放置1 h，4℃，12 000 r·min－1离心30 min。上清液进行蛋白定量，各组取总蛋白30 μg加入上样缓冲液煮沸3 min变性，SDS-PAGE分离蛋白，电转移至硝酸纤维素膜上。应用3%脱脂奶粉室温封闭30 min，加入1∶1 000稀释的TrkB、p-Akt 1抗4℃孵育过夜，与1∶10 000稀释的2抗室温孵育1 h，再与化学发光试剂温育1 min后曝光、显影和定影，测定吸光度。

1.7 统计学方法数据以均数±标准差(±s)表示，用SPSS12.0进行ANOVA检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 避暗实验和Y型迷宫实验结果与假手术组比较，模型组潜伏期明显缩短，错误次数明显增加;Pro各剂量组潜伏期较模型组明显延长，错误次数减少。模型组出现明显学习记忆功能障碍，与假手术组比较，累计电击次数增加，正确反应次数减少。与模型组比较，Pro各剂量组累计电击次数明显减少，正确反应次数增加，差异有统计学意义，见表1。

2.2 TrkB表达及Akt活化免疫组织化学结果显示，假手术组TrkB及p-Akt阳性细胞数较少;模型组缺血-再灌注后细胞数无明显增多;Pro各剂量组细胞数显著上调。Western Blot结果提示:与假手术组比较，模型组大鼠皮质TrkB及p-Akt表达无显著变化，Pro各剂量组大鼠皮质TrkB及p-Akt表达显著增高(n=6)，见图1。

3 讨论

Pro化学成分为2，6-二异丙基苯酚，与内源性抗氧化剂生育酚在结构上相似，该结构可与氧自由基反应并使之灭活，从而抑制氧自由基介导的脂质过氧化作用，降低自由基的产生，调节炎症细胞趋化因子，减少炎症细胞聚集，进而减轻炎症细胞对机体的损伤，具有一定的抗脑缺血-再灌注损伤作用[6]。但其对缺血-再灌注所致认知功能障碍的影响笔者尚未见报道。

表1 4组大鼠避暗实验和Y型迷宫实验结果Tab.1Result of step-down test and Y-maze task test of 4 groups animals次，±s

表1 4组大鼠避暗实验和Y型迷宫实验结果Tab.1Result of step-down test and Y-maze task test of 4 groups animals次，±s

与模型组比较，*1P＜0.05，*2P＜0.01;与假手术组比较，*3P＜0.01Compared with model group，*1P＜0.05，*2P＜0.01;compared with sham operation group，*3P＜0.01

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图1 4组大鼠皮质TrkB表达(A)及Akt活化(B)情况Fig.1TrkB expression(A)and Akt activation(B)in cortex of 4 groups of rats

脑缺血-再灌注后可导致缺血、低氧及周边区域神经细胞的坏死和凋亡，其机制与诱导多种基因的表达，包括促凋亡基因和抑制凋亡基因有关。TrkB作为NGF的高亲和力受体启动了神经元分化及存活的信号级联反应[7-8]，缺血-再灌注损伤4 h后，缺血侧皮质就有TrkB表达升高，并且此升高一直持续到再灌注后第3天，TrkB的升高对缺血性脑损伤具有保护作用[9-10]。

笔者在本实验中利用线栓法造成大脑中动脉栓塞的局灶性脑缺血-再灌注，制备大鼠学习记忆功能障碍模型。研究结果表明，Pro能延长避暗实验中潜伏期，减少错误次数，减少Y型迷宫实验中累计电击次数，增加正确反应次数。提示Pro可改善脑缺血-再灌注损伤所致学习记忆障碍。本实验中，假手术组TrkB及p-Akt阳性细胞数较少，模型组细胞数无明显增多，而Pro各剂量组细胞数显著上调。与假手术组比较，缺血-再灌注后大鼠皮质TrkB及p-Akt表达差异无统计学意义;而Pro各剂量组大鼠皮质TrkB及p-Akt表达则显著增高。

综上所述，Pro能明显减轻脑缺血-再灌注所致认知功能障碍，可能通过调节缺血-再灌注损伤时保护性NGF的高亲和力受体TrkB的表达和Akt活化，激活其下游信号分子，间接发挥其抗缺血性脑损伤的作用，但其对下游信号分子的具体作用机制尚需进一步研究。

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