脑缺血再灌注损伤后不同时间点施眼针对大鼠海马组织BDNF表达的影响*

王德山，王 哲，王守岩，马贤德，高 原，赵金茹，关洪全

(辽宁中医药大学，沈阳 110847)

脑缺血再灌注损伤后不同时间点施眼针对大鼠海马组织BDNF表达的影响*

王德山，王 哲，王守岩，马贤德，高 原，赵金茹，关洪全

(辽宁中医药大学，沈阳 110847)

目的:探讨眼针治疗CIRI的时间-效果关系以及可能机制。方法:应用线栓法复制CIRI大鼠模型，于再灌注后3h、24h及72h进行眼针刺激，检测神经功能缺损评分，同时检测大脑海马组织BDNF蛋白及基因表达。结果:与模型组比较，眼针组神经功能缺损评分降低，同时海马组织BDNF表达呈时间依赖性上调(P＜0．01)。结论:眼针能够改善CIRI神经功能损伤，并具有时间-效果依赖性，其机制可能与对抗损伤脑组织BDNF表达进行性下调有关。

眼针;大鼠;脑缺血再灌注损伤;脑源性神经营养因子;海马

眼针疗法是我国针灸家彭静山教授于20世纪70年代始创［1］，依据中医学基本理论以瞳孔为中心放射形地将眼眶周围划分为"八区十三穴"，并将其与五脏六腑以及上、中、下焦相配属，根据疾病所属脏腑选择不同穴区针刺达到防治疾病的一种微针疗法。30余年逾百万计病例证明，眼针对多种疾病均有疗效［2、3］，特别是对脑缺血致残性疾病效果突出［4、5］。本研究通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤(CIRI)模型，观察在CIRI后不同时间点进行眼针刺激对大鼠神经功能缺损评分和海马组织脑源性神经营养因子(brain-derived neuro-trophic factor，BDNF)表达的影响，旨在探讨眼针治疗 CIRI的时间-效果关系，为临床建立眼针治疗CIRI方案提供依据。

1 材料与方法

1．1 动物与分组

健康SPF级SD大鼠120只，雌雄不拘，体质量280g±20g，由北京维通利华实验动物中心提供(许可证编号SCXK(京)2007-0001)。适应性喂养1周后分为10组，即正常组、假手术组、模型组、眼针组分3h、24h、72h各3组，每组12只。模型组和眼针组动物在模型复制成功后再次进行随机分组。

1．2 动物模型复制与评价标准

参照文献［6］，模型组及眼针组采用改良的线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血(CIRI)模型，再灌注时间为缺血 2h后进行。CIRI模型成功标准:参照Longa评分标准［7］对再灌注后动物进行神经功能缺损评分。0分为无症状;1分为不能完全伸展对侧前爪;2分为向对侧转圈;3分为向对侧倾倒;4分为不能自发行走，意识丧失。评分为1～3分者纳入实验组，未达标准者排除。假手术组术式同模型组和眼针组，但是栓塞线插入深度为0．5cm，不进行栓塞处理。正常组未做任何处理。

1．3 眼针取穴及刺法眼针取穴参照文献［8］选取双侧肝区、上焦区、下焦区、肾区穴。刺法:用31号13mm毫针，采用横刺法。于大鼠眼眶外缘处，按照穴区1→8区的顺序，由穴区定位线起点进针，刺入皮下横刺到另一穴区起点线，保持针体在所选穴区内。刺入后不提插捻转，留针20min，留针期间在10min时刮针柄5次，以加强刺激。治疗时间:3h眼针组于脑缺血再灌注后即刻和取材前30min分别进行眼针刺激，计2次;24h、72h组每间隔12h眼针1次，最终24h组眼针计4次，72h组眼针计8次。刺法同3h组。

1．4 试剂

实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa大连宝生物。BDNF引物由北京华大基因公司合成。亲和纯化兔抗鼠BDNF多克隆抗体、DAB染色试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1．5 检测指标测定

1．5．1 海马组织BDNF蛋白表达(Western blot法) 于缺血再灌注损伤3h、24h、72 h给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉后断头取出脑组织，去掉小脑，沿两侧大脑半球连接处将大脑半球切开，剥离出病变侧海马，按海马组织净重∶裂解液 =1∶10的比例，加入相应体积的裂解液，pH值为7．5，将样品剪碎后匀浆、离心、上清即为总蛋白。兔抗鼠BDNF一抗(1∶500);O-dianidine，β-naphthyl acid phosphate 显色;扫描仪扫描NC膜，分析结果。

1．5．2 海马组织 BDNF mRNA的表达 采用RQ-PCR方法:BDNF上游引物:5'ATGGGTTA CACG AAGGA 3';AQP4下游引物:5'GCCCGAA CATACGATT3'。β-actin为内参，其上下游引物分别为:5'CGT GCGTGACATTAAAGAG 3'，5'TTGCCG ATAGTGA TGACCT 3'。所有产物，在 ABI Prism 7500 HT序列检测系统中运行。读取CT值，以管家基因β-actin为内参，以扩增倍数作为比较的依据，△CT=CT目的基因-CTβ-actin，△△CT=△CT实验－△CT对照，扩增倍数=2－△△CT。将所扩增的PCR产物同时进行溶解曲线分析。

1．6 统计学处理

2 结果

2．1 不同时间点施眼针对模型大鼠神经功能缺损评分影响

本实验过程中大鼠死亡32只，因此最终各实验组动物样本数出现差异。模型复制成功后动物均出现不同程度的神经功能障碍，如提尾时左侧前肢不能伸直，行走向对侧旋转或倾倒等。假手术组与正常组大鼠无神经功能障碍表现。神经功能缺损评分结果如表1所示，与正常组和假手术组比较，模型组评分值明显增高(P＜0．01)。眼针刺激后3h、24h、72h组与模型组比较，神经功能缺损评分均较模型组有显著降低(P＜0．01);其中 3h、24h组评分较72h组更低，但是3个不同时间点之间没有显著性差异(P ＞0．01)。

表1 不同时间点施眼针对模型大鼠神经功能缺损评分影响

2．2 不同时间点施眼针对模型大鼠海马组织BDNF蛋白表达的影响

图1、表2为采用 Western blot方法检测结果:取大鼠右侧海马组织检测BDNF蛋白，以β-actin为内参，模型组海马组织不同时间点BDNF蛋白表达均明显低于其他各组，并且BDNF蛋白表达呈现时间依赖性下调;模型组组内3个时间点比较，72h组BDNF蛋白表达最低(P＜0．01)。眼针组 BDNF蛋白表达明显高于模型组(P＜0．01)，其中眼针3h和24h组与72h组比较，72h组明显低于前2组(P＜0．01)。这可能与脑缺血再灌注损伤72h时 BDNF蛋白表达下调更明显有关。

表2 不同时间点施眼针对模型大鼠海马组织BDNF蛋白表达(灰度值)影响

图1 眼针对脑缺血再灌注损伤模型大鼠海马组织BDNF蛋白表达影响

2．3 CIRI后不同时间点施眼针对大鼠海马组织BDNFmRNA表达的影响

采用实时定量PCR方法检测海马组织BDNFmRNA表达，本实验选用 β-actin作为内参，BDNF基因扩增产物大小为86bp，β-actin基因扩增产物为132 bp。其检测结果如表3所示，与正常组和假手术组比较，模型组海马组织BDNF mRNA表达明显减少，并且也呈现出时间依赖性下调，特别是72h组与3h组比较差异显著(P＜0．01)。与模型组比较，眼针组的3个时间点 BDNF mRNA均呈现高表达(P＜0．01)，但3个时间点间没有显著性差异(P ＞0．01)。

表3 不同时间点施眼针对模型大鼠海马组织BDNFmRNA表达影响(倍数)

3 讨论

BDNF是神经营养因子家族重要成员之一，是由Barde等在1982年从猪脑中首先分离和纯化出的神经生长因子。BDNF广泛分布在脑中枢各个部位，包括大脑皮层、海马、基底前脑、纹状体、下丘脑和小脑等。BDNF不仅分布于神经细胞体内，而且延伸到突起纤维中，是脑组织中含量最多的神经营养因子之一，具有调节神经系统发育、促进成熟、维持神经元生长等功能。体外及体内实验研究均证实，BDNF在神经元存活、神经发生分化和增殖以及学习、记忆等方面扮演着重要的角色［9］。近来研究已表明，BDNF在脑缺血再灌注损伤缺血周边区域神经元的损伤修复中发挥了重要作用［10］。当机体发生脑缺血再灌注损伤后，其脑神经细胞的损伤程度与BDNF的表达水平密切相关，BDNF mRNA表达水平增强能够提高神经元抗缺血再灌注损伤的能力［11］。从而证明了 BDNF在维持神经元功能及其损伤后再生修复方面发挥着重要作用。

本实验结果显示，与正常组和假手术组比较，模型组中不论是3h、24h还是72h组的神经功能缺损评分均明显呈现出高值，表明本实验中的CIRI模型复制是成功的。与模型组比较，眼针组中3个时间点的神经功能缺损评分出现明显下降，证明眼针治疗能够改善CIRI模型大鼠的神经功能以及整体状态。

BDNF的检测结果表明，模型组3h、24h和72h组海马组织BDNF不论是蛋白还是基因表达均呈现时间依赖递减性下调，以缺血再灌注72h时BDNF表达下调最为明显，提示在脑缺血再灌注损伤后的72h期间，其脑组织损伤程度具有进行性加剧的趋势，即脑缺血再灌注后经历时间越长脑损伤越加重。经过眼针刺激后，伴随着CIRI模型大鼠整体状态的好转其神经功能缺损评分也呈现明显下降，同时眼针组大鼠海马组织的BDNF表达在3个不同时间点上也呈现出同步上调，说明CIRI模型大鼠神经功能损伤与脑组织中BDNF表达下调具有密切的关系。比较本实验中眼针组与模型组相对应的3个时间点的BDNF表达结果发现，尽管模型组BDNF表达呈时间依赖性下调，以 72h达到最低，但是眼针组BDNF表达却没有出现呈时间依赖性下调，即使在72h组其表达与其他2个时间点也并无显著性差异。此结果不但表明眼针可能通过增强脑组织BDNF表达以提高脑组织的抗损伤能力，同时也提示，眼针治疗的次数增加能够明显提高脑组织BDNF表达以加强眼针的治疗效果，即眼针治疗存在着“时间-效果”依赖性关系。

根据本实验结果初步认为，由于缺血性脑组织的BDNF表达在脑缺血再灌注后，具有时间依赖性下调的现象，这种表达下调有加剧神经功能缺损的作用。因此，临床上应用眼针治疗脑缺血性疾病应尽早施行。鉴于眼针对脑缺血再灌注损伤治疗存在着“时-效”性关系，所以对于脑缺血再灌注性疾病在进行早期治疗同时，还应该在可能的情况下尽量增加眼针刺激的次数，以增强眼针的治疗效果。

［1］彭静山．眼针疗法［M］．沈阳:辽宁科学技术出版社，1990:11．

［2］李 志．眼针改善慢性脑供血不足患者认知功能障碍［J］．中国针灸，2009，29(10):791-793．

［3］曹银香，白炜玮，冯金萍，等．眼针治疗脑梗死半身不遂156例临床观察［J］．河北中医，2008，30(3):286-287．

［4］周鸿飞，黄春元，鞠庆波，等．眼针与头针对脑梗塞进行分期治疗的临床观察［J］．针灸临床杂志，2006，22(4):3-5．

［5］王鹏琴．眼针治疗出血性中风138例［J］．辽宁中医杂志，1998，25(4):180-180．

［6］马贤德，孙宏伟，王守岩，等．线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究［J］．中华中医药学刊，2009，27(6):1200-1201．

［7］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S et al，Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats．Stroke［J］．1989，20(1):84-91．

［8］王艳杰，王德山，关洪全，等．眼针疗法对肠易激综合征大鼠血清和结肠组织P物质和 VIP含量的影响［J］．针刺研究，2010，35(1):8-11．

［9］Marini A M，J iang X，Wu X，et al．Preconditioning and neurotophins:amodel for brain adaptation to seizures，ischemia and other stressful stimuli［J］．Am ino Acids．2007，32:299-230．

［10］刘 崴，程 焱，王 虔，等．脑源性神经营养因子与缺血性脑损伤［J］．国外医学·脑血管疾病分册，2004，12(6):433-436．

［11］Schabitz WR，Berger C，Kollmar R，et al．Effect of brain-derived neurotrophicfactor treatment and forced arm use on functional motor recovery after smallcortical ischemia［J］．Stroke．2004，35:992-997．

Effect of Eye acupuncture therapy on BDNF expression in rats with hippocampus ischemia-reperfusion injury at different time periods

WANG De-shan，WANG Zhe，WANG Shou-yan，MA Xian-de，GAO Yuan，ZHAO Jin-ru，GUAN Hong-quan(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang110847，China)

Objective:To investigate time-effect relationship between eye acupuncture and curative effect of CIRI and the possible mechanisms．Methods:Establishing the rat model of CIRI with suture method．3h，24h and 72h after reperfusion，the neurophysical behaviours were accessed by ZeaLonga neurophysical impairment marks．The methods of Western-blotting and RQ-PCR were taken to detect the alteration of the BDNF protein and BDNF mRNA in rat hippocampus after the eye acupuncture therapy．Results:The expression of the BDNF protein and BDNF mRNA in rat hippocampus after the eye acupuncture therapy was strongly increased at 3h，24h and 72h．The expression of the BDNF at 24h were higher than those at other periods(P ＜ 0．01)．Conclusion:The eye acupuncture therapy can improve the CIRI evidently，the curative effect at 24h is superior to that at 3h and at 72h．It is related to increasing the expression of hippocampus BDNF．．

Eye acupuncture;cerebralischemia-reperfusion injury;brain-deprived neurotrophic factor;hippocampus;real-time fluorescence quantitative polyme rase chain reaction

R245．32+9

B

1006-3250(2012)02-0200-03

国家重点基础研究发展计划项目(2007CB512702)

王德山(1951-)，男，辽宁大连人，教授，医学硕士，从事中医药对消化道神经内分泌功能影响机制研究。

2011-07-27