壮骨止痛方治疗大鼠去卵巢骨质疏松症的蛋白质组学分析*

杨 军，莫新民△，李劲平

(1．湖南中医药大学，长沙 410007;2．中南大学，长沙 410208)

壮骨止痛方治疗大鼠去卵巢骨质疏松症的蛋白质组学分析*

杨 军1，莫新民1△，李劲平2

(1．湖南中医药大学，长沙 410007;2．中南大学，长沙 410208)

目的:探讨壮骨止痛方治疗骨质疏松相关蛋白改变谱。方法:利用二维凝胶电泳分离股骨组织的总蛋白，通过软件分析2-DE图谱，比较各组间蛋白的表达量，然后利用MALDI-TOF-MS制作差异蛋白点的肽谱，确定各差异蛋白的种类，通过生物信息学分析所得蛋白的功能。结果:壮骨止痛方能调节骨骼肌的能量代谢、物质转运，对大鼠去卵巢骨质疏松症产生调节作用。

壮骨止痛方;蛋白质组学;骨质疏松症

△通讯作者:莫新民，男，教授，博士研究生导师，湖南长沙市雨花区韶山中路113号湖南中医药大学研究生院。

骨质疏松症(OP)是以骨量减少，骨小梁变细、断裂、数量减少，皮质骨多孔、变薄等骨的微观结构退化为特征，以致骨的脆性增高及骨折危险性增高的一种全身性骨病［1］，多发生在绝经后妇女、老人和多种慢性疾病患者。雌激素在西医临床治疗该病中为主要用药之一。壮骨止痛方是根据中医传统医理，在临床治疗该病疗效显著的方药，为探明其治疗途径以及微观机理，本实验采用蛋白组学方法，从分子生物学角度研究该方的作用机制。

1 材料与方法

1．1 材料和试剂

1．1．1 实验动物 SPF级 30只 3月龄雌性SD大鼠，体重250g±10g左右，由湖南省中医药大学实验动物中心提供(合格证号 SCXK(湘)2009-0004)，购进大鼠后在湖南中医药大学SPF级实验室进行适应性饲养。

1．1．2 试剂 丙烯酰胺、甲双叉丙烯酰胺、Tris-base、SDS、巯 基 乙 醇、Triton x-100、Urea、TEMED、过硫酸氨和考马斯亮蓝G-250等购自上海生物工程技术服务有限公司，两性载体电解质和甘氨酸购自北京经科试剂公司，三氟乙酸(TFA)为日本东京化成工业株式会社产品，碘乙酰胺购自Sigma公司，乙氰(CAN)为国产色谱纯，其他试剂均为国产分析纯试剂。

1．1．3 壮骨止痛方药液 壮骨止痛方全方提取液(由中南大学药学院按标准流程提取)，灌胃时全方药物为油相和水相混合物。

1．1．4 主要设备 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱系统(MALDI-TOF-MS)为美国Applied Biosystems公司产品，圆盘电泳槽和高压稳压稳流电源(北京六一仪器厂产品)、普通台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、低温高速离心机(Beckman公司)。

1．2 动物造模

SPF级SD雌性大鼠购进后在动物房中适应性饲养3d～5d，随机分为假手术组、模型组和壮骨止痛方组。术前常规用 2%戊巴比妥钠(0．2mL/100g)麻醉动物，模型组动物切除双侧卵巢，假手术组仅进行手术操作，只切除部分脂肪但保留卵巢，术后各组动物用青霉素抗炎治疗7d;壮骨止痛方组在消炎7d后开始灌胃(剂量为0．6ml水相 +0．4ml油相/100g)，假手术组和模型组则每天用等量生理盐水灌胃1次，共灌胃13周。

1．3 大鼠股骨组织蛋白样品的提取和处理

实验大鼠在最后1次灌胃后禁食24h，用2%的戊巴比妥钠(0．2mL/100g)腹腔注射，麻醉后将大鼠仰卧固定于手术架上，用碘伏消毒手术部位，手术剪剪开腹腔后采集标本，取大鼠左后肢股骨剔除附着的肌肉筋膜，保留骨膜，生理盐水冲洗后，将骨放入同一陶瓷研钵中进行液氮研磨至粉末状。取0．5g粉末加入 1ml样品提取缓冲液，充分混匀，4℃12000g离心 10min，去除不溶性颗粒，取上清液200μl，以1∶10比例加入样品提取缓冲液，置水浴10min以消化核酸，超声处理5min进一步裂解核酸，加入终浓度为 80%，4℃预冷丙酮，4℃静置10min，12000g离心 10min弃上清，用 200ul样品提取缓冲液重新溶解沉淀，吸取上清液即为提取的组织总蛋白质，移至一干净的 Eppendrof管中保存至－80℃备用。另取5μl上清液用2D Quant Kit蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。

1．4 双向电泳

用pH8-10的两性电解质配制IEF胶条。第一向预电泳 200V 30min、300V 30min、400V 2h，上样后电压400V 12h后调到 600V 6h。另外，用 12．5%SDS-PAGE凝胶上端使IPG胶条与凝胶上端紧密贴合，在一端加入凝胶电泳蛋白质标准品，排尽气泡后，用含痕量溴酚蓝0．5%的琼脂糖封顶，待琼脂糖冷却凝固后装入 Ettan DALT垂直电泳槽中。设置Ettan DALT电泳条件为:每胶 2．0(2．5)W 电泳30min后再以每胶10(12)W恒功率电泳，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底边处1cm处停止电泳。第二向电泳总时间约需用6h左右，电泳结束后用考马斯亮蓝 G-250染色。使用 ImageScanner 2D Platinum 6．0图像分析软件，对凝胶进行系统扫描做图像分析。

1．5 质谱样品的制备

比较3组双向电泳图谱，找到差异蛋白，从胶上切下，切成 1mm3大小置于 0．5ml的 Eppendorf管中，先后进行脱色、酶解、萃取、脱盐、低温真空离心等处理后，与 HCCA基质混匀，取2μL点于样品靶上室温干燥，插入质谱仪的样品室中打谱。

1．6 质谱分析

质谱样品使用美国基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱系统MALDI-TOF-MS进行分析，采用反射模式，离子源加速电压1为20000V，加速电压2为23000V，N2激光波长337nm，脉冲宽度3ns，离子延迟2000nsec，真空度4×10－7pa，质谱信号单次扫描累加50次，用标准Marker峰作为外标校正质谱峰，正离子谱测定获得肽质量指纹图谱。

1．7 数据库的查询

通过 Matrixscience公司网站提供的Mascotwizard软件进行，具体按照 http∥www．matrix science．com/cgi/search．fromselecthtml进 行 查 询。查询条件:分子量、等电点未作限定，肽片断分子量的误差范围100ppm，未水解的酶位点数为1，蛋白种属选择大鼠，Mass values选择为 MH+，选择Monoisotopic，固定修饰选择为Carbamidomethyl(C)，可变修饰不选。

2 结果

2．1 卵巢切除术后骨质疏松模型造模成功的检查

通过骨密度、生物力学、病理学检测显示，模型组和假手术组相比较，腰椎骨密度明显下降，骨小梁稀疏、破坏，髓腔扩大，骨梁髓比明显下降，右胫所能承受的最大压力下降，说明大鼠去卵巢后不仅有骨量的减少，还有骨强度的下降，这些特征与绝经后骨质疏松的生理改变类似，说明本实验中的病理模型复制成功。

2．2 大鼠骨组织蛋白双向电泳图谱的比较

图1 大鼠股骨组织蛋白双向电泳各组图谱的比较

图1显示，3张图谱非常相似，蛋白点主要集在pI5-7和Mw 10～100KD区域。从整个图谱分析，肉眼可辨别大约320多个蛋白点，且蛋白点之间区分比较清晰，可以对其进行蛋白质表达的差异分析。对模型组、全方组、假手术组股骨组织蛋白双向电泳图谱比较，共发现32个明显差异蛋白，其中重点选择了3个差异蛋白进行分析，分别命名为Px1、Px2、Px3，其分子量依次约为43kD、79kD、44kD。表1显示，采用双向电泳图谱分析软件(Ge-nomic So1utions Investigator HT Analyzer version 2．02)对差异蛋白的相对含量进行分析。

表1 大鼠股骨组织蛋白双向电泳图谱差异蛋白在各组的相对含量比较

2．3 MALDI-TOF-MS肽质量指纹图谱分析

对3个差异蛋白进行MALDI-TOF-MS分析，得到各自的肽质量指纹图谱。图2显示，3个肽质量指纹图谱信号较强，基线平稳，适合进一步数据库检索鉴定。根据得到的肽质量指纹图谱数据，通过Marx scienee网站提供的Mascot wizard软件查询与之相匹配的蛋白，搜索结果见表2(仅列示PX1的指纹图谱)。

图2 大鼠股骨组织蛋白2-DE图谱中蛋白PX1的肽质量指纹图谱

由搜索结果可看出，Px1为血清转铁蛋白，Px2为肌酸激酶A，Px3为果糖二磷酸醛缩酶A。

表2 Px1、Px2、Px3在数据库搜索的结果

3 讨论

通过比较不同组间股骨蛋白质分子以及图谱，找到了相对应的差异蛋白质，根据它们质和量的不同，分别命名为 Px1、Px2、Px3。

Px1与之相对的蛋白是Creatine kinase M-type，即肌酸激酶A型。肌酸激酶是一种转移酶类，它广泛分布于各组织中，分别为 MM(肌肉型)、BB(脑型)、MB(杂化型)，其中M型主要分布在骨骼肌中。研究表明，哺乳动物肌细胞收缩的能量来源于ATP，肌细胞内 ATP的数量足以满足肌肉收缩30～100次的需要，而肌酸激酶则为快速恢复ATP含量所必需的高能磷酸化合物，静息状态下肌肉组织中的磷酸肌酸的浓度为ATP的3～8倍。肌细胞收缩消耗ATP后，磷酸肌酸随即予以补充，即磷酸肌酸在肌酸激酶的作用下，迅速将高能磷酸键转移到ADP上生成ATP，以供肌细胞的活力;骨质疏松时，骨骼肌收缩力下降，肌肉活力减退，因此肌酸激酶在骨质疏松中有很重要的作用，在实验中，全方组肌酸激酶的活力最强，假手术组居中，模型组最低，说明壮骨止痛方有可能是通过提高肌酸激酶的活力来达到治疗骨质疏松症的。

Px2与之相对的蛋白是 Serotransferrin，即血清铁传递蛋白，转铁蛋白是一个能够和铁相结合的蛋白家族［2］。转铁蛋白具有多态性，主要被划分为血清转铁蛋白、卵(清)转铁蛋白、乳(清)转铁蛋白3类。血清转铁蛋白来源于血清，还存在于其他体液如胆汁、羊水、脑脊液、淋巴液和乳汁中，通过这些生物体液结合并转运铁离子，其主要作用是在铁的吸收、贮存、利用中扮演着运输的角色，它调控着铁的代谢，阻止游离铁通过自由基的形成对细胞的毒副作用，运输细胞外的铁［3］，每分子转铁蛋白能结合二元子铁，因为细胞内的许多酶，例如核糖核苷酸还原酶，需要以铁作为辅基，因此转铁蛋白对细胞的存活和生长十分重要。另外，转铁蛋白还能结合、输送其他金属离子、治疗性金属离子、诊断用的放射性金属离子等。近年来，许多研究结果认为体内铁代谢平衡和紊乱与骨质矿化有着密切的联系。在研究绝经女性骨质疏松治疗、预防时发现，铁的摄入与骨的矿化密度呈正相关［4、5］。在本实验中，模型组该蛋白相对表达，在假手术组相对较高，全方组表达最高，说明切除卵巢也许破坏了转铁蛋白的运输通道，经过壮骨止痛方的治疗，在某些方面恢复了铁的重新正常转运，从而达到治疗骨质疏松症的作用。

Px3与之相对的蛋白是Fructose-bisphosphate aldolase A，即果糖二磷酸醛缩酶 A，醛缩酶是糖酵解过程中的一个重要酶类，能催化果糖-1，6-二磷酸(FDP)和果糖-1-磷酸(FIP)为底物的裂解，将其分解为3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮。目前研究表明，哺乳动物组织中存在3种ALD同工酶，为A型(肌型)、B型(肝型)、C型(脑型)，其中 A型主要存在于肌肉组织中［6］。在临床中，经常以FDP/FIP的比值为单位来测量人体组织，特别是肌肉组织中的醛缩酶活力［7］。在人体活动时，均需要消耗能量ATP，在ATP的合成过程中，醛缩酶A在糖原或葡萄糖生成ATP，同时反映生成丙酮酸或乳酸的过程中，并发挥重要的作用［8］，尤其是 1，6-二磷酸果糖转化为3-磷酸甘油醛中尤显重要，在整个反应过程里，ATP产生的越多肌肉细胞则能自由运动，如果肌酸产生过度，肌肉则活动无力甚至易疲劳，故有人把肌酸称为“疲劳素”。在本实验中，假手术组醛缩酶A表达值最高，全方组次之，模型组最低，说明大鼠去卵巢后，醛缩酶A的作用下降，全方组在调整醛缩酶A的活力方面起到了重要作用，也验证了该方对绝经后骨质疏松症有良好疗效。

［1］刘忠厚．骨质疏松学［M］．北京:科技出版社，1998:142．

［2］钟志容，等．转铁蛋白及其受体作为药物载体的研究进展［J］．沈阳药科大学学报，2006，10(23):666-667．

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［6］侯振江，张宗英．醛缩酶检测及其临床应用［J］．世界今日学杂志，2001，2(4):369-371．

［7］方允中，陈能乾．医学酶学［M］．北京:人民卫生出版社，1984:283．

［8］余志斌，等译．骨骼肌结构能与功能［M］．西安:第四军医大学出版社，2010:225．

R285．5

B

1006-3250(2012)02-0166-03

2009年国家自然科学基金面上项目(30873291)

杨 军(1971-)男，甘肃兰州人，主治医师，讲师，在读博士，从事中医老年病研究。

2011-07-15