rno-miRNA-133b对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

黄伟聪，王珏，，杨凯，旷文安，张浩，孙成超

（1.温州医学院附属第一医院 心胸外科，浙江 温州 325000；2.北京阜外心血管病医院 再生医学实验室，北京 100037）

骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）具有取材方便、能进行体外培养、免疫原性低、可诱导分化成不同类型的成熟细胞等优点，目前已成为再生医学研究中的热点种子细胞，在心血管疾病及其他疾病的治疗中有着广泛的研究和应用前景[1-2]。但是，由于BMSCs在骨髓中原始数量少，需要长时间的体外扩增才能达到临床研究和应用的数量要求，因此增强BMSCs增殖的能力在临床干细胞研究和治疗应用中至关重要。

miRNAs是近年来发现的一类内源性非编码单链RNA，长度在20～23个核苷酸，在种属间具有高度保守性，其通过抑制靶点mRNA的翻译或者促进降解而对基因的表达发挥负调控作用，参与调控生命细胞水平的一系列重要进程，包括细胞增殖、凋亡、分化及肿瘤形成等[3]。体外研究中发现miRNA-133b对心脏成纤维细胞、心肌祖细胞及平滑肌内皮细胞增殖具有调控作用[4-6]。本研究为了确定miRNA-133b对BMSCs的作用，在体外培养条件下，利用siPORT NeoFX转染rno-miRNA-133b模拟物（mimic）/抑制剂（inhibitor）至大鼠来源的BMSCs，上调/抑制细胞中miRNA-133b活性以探讨其对BMSCs增殖和凋亡的影响，并利用生物信息学方法预测其靶点基因，初步分析miRNA-133b影响BMSCs增殖的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 Spraque Dawley（SD）大鼠由温州医学院实验动物中心提供，体质量60 g，研究经温州医学院实验委员会批准。

1.2 主要试剂 DMEM培养基、PBS、青链双抗、胰蛋白酶（北京四环生物有限公司），胎牛血清FBS（美国Gibco公司）。MTS细胞增殖/毒性检测试剂盒（美国Promega公司），Brdu细胞增殖比色法测定试剂盒（美国eBioscience公司）。TUNEL荧光法凋亡检测试剂盒（德国Roche公司），rno-miR-133b mimic、inhibitor及其阴性对照（NC）（上海吉玛公司）。rnomiR-133b mimic序列为sense：5’-UUUGGUCCCCUUCAA CCAGCUA-3’，antisense：5’-GCUGGUUGAAGGGGACCAAA UU-3’；rno-miR-133b mimic NC序列为sense：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，antisense：5’-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3’；rno-miR-133b inhibitor序列为5’-UAGCUGGUUGAAGGGGACCAAA-3’；rno-miR-133b inhibitor NC序列为5’-CAGUACUUUUGUGUAGUA CAA-3’。SiPORT NeoFX转染试剂（美国ABI公司）。

1.3 仪器设备 细胞培养超净台GB-II（北京长城空气净化设备公司），CO2恒温细胞培养箱（美国Thermo公司），酶标仪Model680（美国BIO-RAD公司），realtime-PCR仪7300（美国AB公司），荧光显微镜及图像采集系统（日本Olympus公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养：原代培养大鼠BMSCs，无菌条件下分离大鼠的股骨和胫骨，以适量DMEM冲出骨髓，用含10% FBS的DMEM培养基在37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h后更换培养基，以后每2～3 d更换培养基，细胞融合70%～80%时用胰蛋白酶消化传代，取生长良好的2代细胞，更换成含5% FBS的DMEM培养基进行以下实验。

1.4.2 转染及实验分组：rno-miR-133b mimic、inhibitor及其各自NC干粉加适量DEPC水配置成终浓度为30μmol/L的工作液。细胞接种后，按照siPORT NeoFX说明书进行转染，并分为4组：过表达组（miR-133b mim组）、过表达组阴性对照组（NC-mim组）、抑制组（miR-133b inh组）、抑制组阴性对照组（NC-inh组），按目的继续培养用于后续实验。

1.4.3 转染效率检测：TaqMan qRT-PCR验证转染效率，接种第二代BMSCs于T25培养瓶中，按1.4.2方法转染及分组，培养24 h后按照Trizol试剂盒说明提取各组总RNA，利用TaqMan miRNA逆转录试剂盒和TaqMan miRNA探针在realtime-PCR仪上行定量PCR，结果以u6 snRNA为内参，利用2-ΔΔCt方法计算目标miRNA-133b的相对表达水平。免疫荧光转染效率检测，用siPORT NeoFX转染带GFP荧光的miRNA于6孔板中爬片的BMSCs，继续培养24 h，更换培养基，4%多聚甲醛固定，Dil染细胞膜，DIAP染核，荧光显微镜下观察并记录。

1.4.4 MTS和Brdu法检测细胞增殖：取生长良好的第二代BMSCs，以每孔1.5×103个细胞接种于96孔板，按1.4.2方法同期做细胞转染及分组，每组设6孔。于转染后24、48和72 h用MTS法各检测一块板，检测时每孔加入20μL MTS检测试剂，并设置调零孔，放于37 ℃，5% CO2培养箱中孵育2 h后，用全自动酶标仪检测OD490值。另于转染后24 h，于每孔中加入BrdU 10μL，并设置细胞背景孔，继续培养12～24 h，按照Brdu细胞增殖比色法测定试剂盒的说明操作，固定细胞，孵育一、二抗并显色，于加入终止液半小时内用全自动酶标仪检测计算OD450－OD595值。

1.4.5 TUNEL免疫荧光染色：取第二代BMSCs以2.5×105/mL细胞密度接种6孔板，每孔2 mL进行细胞爬片，按1.4.2方法转染及分组后继续培养48 h，按TUNEL荧光法凋亡检测试剂盒说明操作，同期行DAPI细胞核染色。荧光显微镜下每张片随机选取9个视野拍片，计数细胞中凋亡细胞所占百分比。

1.4.6 靶基因预测及基因功能分类：采用Target-Scan和PicTar两个数据库进行miRNA-133b检索，预测其靶点基因，并对这些靶点基因进行初步基因功能分类。

1.5 统计学处理方法 采用SPSS16.0统计软件，数据以±s表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siPORT NeoFX转染miRNA-133b效率检测 利用siPORT NeoFX转染带GFP荧光的miRNA在荧光显微镜下观察发现，GFP荧光成功出现在BMSCs中（见图1）。同时利用TaqMan qRT-PCR检测转染效率发现利用siPORT NeoFX转染的miR-133b mim组较NC-mim组能够明显上调细胞中的miRNA-133b表达（P<0.01），而miR-133b inh组较NC-inh组能够明显下调细胞中的miRNA-133b表达（P<0.01）（见图2）。

图1 荧光显微镜下见绿色荧光出现在BMSCs细胞中（右）（DiL染细胞膜，DAPI染核，×400）

图2 TaqMan qRT-PCR验证转染效率（以u6 snRNA为内参，计算与各自的NC组之比：aP＜0.01，n=3)

2.2 miRNA-133b mimic和inhibitor对BMSCs增殖能力的影响 BMSCs接种于96孔板并行同期转染后24、48和72 h行MTS法检测活细胞数（见表1），发现转染后24～72 h miR-133b mim组OD490值明显高于NC-mim组（P<0.05）。而转染后24～72 h miR-133b inh组OD490值明显低于NC-inh组（P<0.05）。相似的结果在转染后24 h的Brdu细胞增殖比色法测OD450－OD595值中再次得到验证（P<0.05）（见表2）。

表1 MTS法检测各组OD490值（n=3±s）

表1 MTS法检测各组OD490值（n=3±s）

与各自的NC组比：aP＜0.05

组别NC-mim组miR-133b mim组NC-inh组miR-133b inh组24 h 0.459±0.12 0.539±0.12a 0.473±0.11 0.444±0.09a 48 h 0.720±0.13 0.753±0.16a 0.733±0.12 0.686±0.10a 72 h 1.028±0.18 1.100±0.19a 1.014±0.17 0.946±0.13a

表2 Brdu法检测各组OD450－OD595值（n=3±s）

表2 Brdu法检测各组OD450－OD595值（n=3±s）

与各自的NC组比：aP＜0.05

组别NC-mim组miR-133b mim组NC-inh组miR-133b inh组24 h 0.873±0.05 1.024±0.13a 0.897±0.04 0.810±0.06a

2.3 miRNA-133b mimic和inhibitor对BMSCs凋亡的影响 TUNEL免疫荧光检测转染48 h后各组细胞凋亡情况，DAPI和TUNEL同时阳性（DAPI+-TUNEL+）的细胞核被认为是发生凋亡的BMSCs，呈现黄绿色荧光（见图3）。各组在凋亡细胞百分比上差异无统计学意义（P>0.05）（见表3）。

图3 TUNEL荧光染色结果（DAPI染核，TUNEL，×400）

表3 TUNEL法检测各组细胞凋亡百分比（n=3±s）

表3 TUNEL法检测各组细胞凋亡百分比（n=3±s）

组别NC-mim组miR-133b mim组NC-inh组miR-133b inh组凋亡细胞百分比（%）4.032±0.13 4.113±0.20 4.250±0.16 4.206±0.19

2.4 miRNA-133b靶基因预测及基因功能分类TargetScan和PicTar两个数据库分析提示，miRNA-133b的靶点中存在部分调节细胞增殖的基因位点（见表4）。

表4 miRNA-133b与细胞增殖调节相关部分预测靶点基因

3 讨论

BMSCs在临床干细胞治疗研究和应用中具有广阔前景，但如何提高BMSCs体外扩增效率是一个亟待解决的问题。研究发现低强度激光照射、改良培养系统及各种细胞因子刺激等能增强BMSCs的增殖[7-8]，但目前对miRNAs与BMSCs增殖方面的研究还比较少。研究发现miRNA-133能够促进肌成纤维细胞和心肌祖细胞的增殖[4-5]，而在血管平滑肌细胞中发现miRNA-133能调控其表型改变，且功能学研究中上调miRNA-133活性能抑制其增殖[6]。相同miRNA在不同细胞中对细胞增殖调控结果的不一致，可能与不同细胞中特异的基因表达相关。本研究为了明确miRNA-133b对BMSCs增殖和凋亡的作用，利用siPORT NeoFX成功地将rno-miRNA-133b mimics/inhibitors转染至大鼠来源的BMSCs，并观察上调/抑制miRNA-133b活性对细胞的影响。结果表明上调/抑制miRNA-133b活性，对细胞凋亡无显著影响，但能够促进/减少BMSCs的增殖，表明miRNA-133b对BMSCs的增殖能力具有调控作用。

目前已发现的miRNA-133家族中主要包括3个成员，即miRNA-133a-1、miRNA-133a-2和miRNA-133b，它们分别与miRNA-1-2、miRNA-1-1和miRNA-206在不同的染色体上如多顺反子一样被同时转录，且miRNA的表达存在细胞、组织和器官的特异性，miRNA-133和miRNA-1家族主要在骨骼肌和心肌细胞中呈高表达。miRNA-133和miRNA-1通过调控Srf、Hand2、CyclinD2、Irx5、Detal等基因参与心肌和骨骼肌细胞的分化、发育等过程[9]。Ning等[10]发现miRNA-133b能通过胰岛素样生长因子（IGF-I）信号调控介导脂肪来源的干细胞分化。另外在肿瘤学研究中，miRNA133家族与多种肿瘤的发生、分化、增殖及迁徙等密切相关[11-12]。本研究中发现miRNA-133b能够促进BMSCs数量的扩增，但在临床研究和应用中的生物安全性是否可靠，对BMSCs分化有无影响，仍需要更深入地研究。

miRNA 5’端第2～7个核苷酸被称为种子序列，可通过碱基互补配对的方式与靶点基因的mRNA 3’端非翻译区（3’UTR）结合发挥基因调控作用[3]。目前生物信息学基于miRNA与其靶点基因mRNA 3’UTR的互补配对的原理，开发了TargetScan、PicTar、RNA22、PITA和miRanda等多种miRNAs靶点基因预测软件。本研究中利用较为常用的TargetScan和PicTar对miRNA-133b的靶点基因进行预测，并利用Gene Ontology数据库对这些可能的靶点进行初步的基因功能分类，发现miRNA-133b的预测靶点基因的功能涉细胞增殖、分化、凋亡、信号转导等。与细胞增殖调节相关的部分预测靶点基因在表4中列出，其中Srf、Furin蛋白在肌成纤维细胞的增殖调控中发挥重要作用[4，13]。Chen等[4]发现miR-133通过负调控Srf基因增强肌成纤维细胞的增殖，而后者作为一种转录因子调控肌成纤维细胞中增殖相关基因的表达。鉴于肌成纤维细胞在生物学特性上与BMSCs具有一定的相似性，miRNA-133b在BMSCs中是否是通过调控Srf基因，或者其他的靶点基因发挥促增殖作用，我们将在下一步研究中进行验证。

总之，我们的研究发现miRNA-133b在不影响BMSCs细胞凋亡的情况下对其增殖能力具有调控作用，而在miRNA-133b靶点基因的验证及其对BMSCs分化上，仍需做进一步研究。

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