3份高羊茅材料吡咯琳－5－羧酸合成酶基因的结构及酶活性比较

牛 熙，冉雪琴，王嘉福，2，陈 超

（1．贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳550025；2．贵州大学农业工程省重点实验室，贵州 贵阳550025）

吡咯琳－5－羧酸合成酶（Pyrroline－5－Carboxylate Synthetase，P5CS）是谷氨酸合成脯氨酸过程中的关键酶。P5CS有催化谷氨酸磷酸化和将谷氨酸－γ－半醛还原成吡咯琳－5－羧酸（Pyrroline－5－Carboxylate，P5C）两种酶活性。P5C再由吡咯琳－5－羧酸还原酶（Pyrroline－5－Carboxylate Reductase，P5CR）催化，生成脯氨酸［1］。脯氨酸是植物主要的渗透压调节物质之一，干旱胁迫下P5CS基因的表达量上升，伴随脯氨酸的合成增加［2］，脯氨酸量的积累与植物的抗旱能力直接相关［3－4］。干旱胁迫下，转P5CS 基因冰草（Agropyron cristatum）中游离脯氨酸量增加，细胞质膜的通透性、丙二醛生成量增幅减缓，超氧化物歧化酶活性增高，抗旱能力明显提高［5］，转基因烟草（Nicotiana tabacum）、水稻（Oryza sativa）、马铃薯（Solanum tuberosum）等植物中也发现类似的规律。高羊茅（Festuca arundinacea）是世界上重要的草坪草和牛羊等的优质饲草，抽穗期高羊茅中粗蛋白含量可超过11%［6］。黔草一号（Qiancao No．1，QC1）和黔草二号（Qiancao No．2，QC2）是贵州省草业研究所利用贵州野生高羊茅资源培育的高羊茅品种，两个品种都有耐践踏、易再生、适应性和抗逆性强等优点［7－8］。但这些培育的高羊茅品种P5CS 基因的结构特点及其与植株抗旱性的关系不甚明了。本研究主要分析人工培育的高羊茅品种P5CS基因结构及其与抗旱性之间的关系。

1 材料与方法

1．1 实验材料及实验设计 高羊茅黔草一号（QC1）和黔草二号（QC2）均由贵州省草业研究所独山实验基地提供，其中黔草二号分为黔草二号细叶（Qiancao No．2n，QC2n）和黔草二号宽叶（Qiancao No．2b，QC2b）。3份高羊茅材料均为生长2年的成熟植株，株高15～17cm，栽种于口径30cm、高24 cm的塑料花盆内。实验于2011年9月在贵州大学农业生物工程重点实验室进行，干旱处理前1d浇透水，浇水量达到花盆上部不再向下渗水为止。停止浇水15d后，植株萎蔫，分别剪取3份高羊茅材料的叶片，用于脯氨酸含量及P5CS酶活性的测定。同时将部分叶片冻存于－80℃，用于RNA的提取。每份高羊茅材料设3个重复。

1．2 实验菌株 大肠杆菌（Escherichia coli TG1）为本实验室储藏菌株。

1．3 主要试剂 pMD18－T vector购自宝生物工程（大连）有限公司；Gel Extraction Kit购自 Omega公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit为 MBI Fermentas公司产品；DNA Marker和质粒小量快速提取试剂盒购自天根生物科技（北京）有限公司。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，核苷酸序列的测定由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1．4 P5CS 基因的克隆

1．4．1 总RNA的提取 取1g叶片于液氮中研磨成粉，以酸酚－异硫氰酸胍－氯仿法提取总 RNA［9］，1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。

1．4．2 P5CS 基因的克隆 参照小麦（Triticum aestivum，NCBI nucleotide accession no．AY888045）P5CS基因序列，设计4对特异性引物P1：5′－ATGGCCGGCGCCGACCCCAA－3′，P2：5′－AAGGAAGGCTCTTATGGGTGTA－3′，mu：5′－AAGGCTCCATATGAGGATTCAT－3′，md：5′－AATCTGGACCAAGGCATCA－3′。引物P1与md组合，预扩增片段1 267bp，得到P5CS基因的上半段；引物P2和mu组合，预扩增片段1 657bp，得到P5CS基因的下半段。

取1μg总 RNA 按 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit说明书合成cDNA，取1μL反转录产物为模板进行PCR扩增。目的片段经1．0%琼脂糖凝胶回收，与pMD18－T载体连接过夜，构建重组质粒，转化感受态大肠杆菌TG1，涂布于IPTG和X－gal的氨苄LB琼脂平板上，37℃培养过夜。挑取白色单菌落，经菌落PCR、质粒PCR鉴定，选取阳性克隆子测定核苷酸序列。

1．4．3 P5CS基因的序列分析 应用DNAStar软件进行序列分析，通过NCBI的BLAST进行核苷酸、氨基酸序列相似性检验，确定开放阅读框（Open reading frame，ORF）；采用瑞士生物信息研究所的蛋白分析系统（Expasy Protein Analysis System）对目的基因进行生物信息学分析，预测P5CS的理化性质。以 MEGA 5．0软件 Neighbor－Joining法分析系统进化树。系统树采用重复1 000次的自展检验（Bootstrap Analysis）。编码蛋白的三维结构经SWISS MODEL（http：／／swissmodel．expasy．org／）在线分析。

1．5 P5CS酶活性及脯氨酸含量测定 取干旱处理后3份高羊茅材料的叶片各1g，参照文献［10］提取蛋白并测定P5CS蛋白酶的活性。采用磺基水杨酸法［11］测定干旱处理后3份高羊茅材料叶片中的脯氨酸含量。

1．6 数据分析 应用SPSS 12．0软件进行方差分析和差异显著性检验。

2 结果

2．1 P5CS 基因的克隆 3份高羊茅材料总RNA经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测，25S、18S和5SrRNA三组条带清晰（图1），提取的总RNA质量良好无降解，可用于后续实验。

图1 甲醛琼脂糖凝胶电泳检测样品总RNA的质量Fig．1 Total RNA detection by 1%formaldehyde－agarose gel electrophoresis

分别以QC1、QC2n及QC2b总RNA进行反转录和PCR扩增，经检测，3份材料各获得1 267和1 657 bp的两种DNA片段，与预期大小相近（图2）。

2．2 P5CS 基因的序列分析 分别将QC1、QC2n和QC2b的P5CS基因扩增片段克隆到T载体中，测序得到1 267和1 657bp两种DNA片段。两种片段间有781bp的重叠，拼接后得到2 151bp序列。与已知序列相比，3份高羊茅材料的2 151bp序 列 与 朝 鲜 碱 茅 （Puccinellia chinampoensis，HQ637435．1）的P5CS基因序列相似性最高，均为

图2 P5CS基因上半段（左）与下半段（右）的扩增Fig．2 Amplification of P5CS gene fragments

注：M 为DL2000DNA Marker；泳道1～3分别为 QC1、QC2n及QC2bP5CS基因上半段；泳道4～6分别为QC1、QC2b及QC2nP5CS基因下半段。

Note：M，DL2000DNA Marker；Lane 1－3，5′－fragments of P5CSgene from samples QC1，QC2nand QC2b；Lane 4－6，3′－fragments of P5CSgene from samples QC1，QC2nand QC2b．94%，与拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻、大麦（Hordeum vulgare）P5CS基因的相似性为68%～91%，编码氨基酸序列的相似性为71%～96%（表1），说明3份高羊茅材料的2 151bp序列的确为P 5CS基因。2 151bp碱基序列为完整的ORF，编码716个氨基酸残基。将QC1、QC2b和QC2n的P5CS基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行比对，3份高羊茅材料P5CS基因的核苷酸序列相似性为98%～99%，编码氨基酸序列相似性均为99%。经Expasy软件分析，QC1的P5CS基因编码蛋白的分子量为77．44kDa，等电点6．38；QC2n的P5CS基因编码蛋白的分子量为77．40kDa，等电点6．19；QC2bP5CS 基因编码蛋白的分子量77．30kDa，等电点5．96。

以人类P5CS氨基酸序列为外群，将3份高羊茅材料的P5CS氨基酸序列与NCBI基因数据库收录的100条P5CS氨基酸序列进行聚类分析，从中选取有代表性的15个物种P5CS氨基酸序列构建系统发育树（图3），QC1、QC2n、QC2b的P5CS与朝鲜碱茅相应蛋白的亲缘关系最近，与小麦、大麦及水稻、玉米（Zea mays）、高梁（Sorghum bicolor）、斑茅（Saccharum arundinaceum）及甘蔗（S．officinarum）聚为一类，而紫花苜蓿（Medicago sativa）、烟草、油菜（Brassica napus）及拟南芥聚为另一类。

将QC1、QC2n和QC2b的P5CS氨基酸序列与拟南芥等植物的相应序列进行比较，3份材料的P5CS蛋白均含有两种酶活性的功能区，一种是谷氨酸激酶（Glu－5－Kinase，G5K），位于 P5CS蛋白的N端，另一种是谷氨酰半醛脱氢酶（Glutamyl 5－Phosphate Reductase，G5PR），位于P5CS蛋白的C端。其中G5K功能区包含ATP结合位点（ATP Binding Site）、亮氨酸结构域（Conserved Leucine Domain）和谷氨酸激酶结构域（Glu－5－Kinase Domain，GK）。G5PR功能区包含NADPH结合位点（NADPH Binding Site）、预测的亮氨酸结构域（Putative Leucine Domain）和氨酰半醛脱氢酶结构域（GSA－DH Domain）（图4）。

表1 3份高羊茅材料与已知P5CS基因比较Table 1 Comparison of P5CS genes between three tall fescues and the known plants %

图3 以P5CS基因编码氨基酸序列构建的系统发育树（N－J法）Fig．3 Phylogenetic tree of P5CS amino acid sequence constructed by Neighbor－joining method with accession numbers

图4 高羊茅P5CS蛋白的保守结构域Fig．4 Diagram of conserved domains in P5CS protein of tall fescue

从QC1、QC2n和QC2bP5CS基因编码的氨基酸序列中，找出6个氨基酸有差异（表2），主要位于P5CS的谷氨酸激酶（G5K）功能区，其中2个位于ATP结合位点的N端，另外4个散布于ATP结合位点和亮氨酸结构域之间的区域。谷氨酰半醛脱氢酶（G5PR）功能区的氨基酸序列完全相同。以SWISS－MODEL在线预测 QC1、QC2n、QC2b和紫花苜蓿P5CS的谷氨酸激酶（G5K）功能区第13－281位氨基酸的三维结构，3种蛋白的谷氨酸激酶（G5K）功能区均由9个α螺旋和13个β片层组成。3份高羊茅材料P5CS蛋白二级结构的差异主要由于第37、85及142位氨基酸所带电荷发生了变化（表3、图5）。与QC1、QC2n、QC2b的P5CS蛋白三级结构相比，紫花苜蓿P5CS蛋白也由9个α螺旋和13个β片层组成，有15个氨基酸所带电荷发生了变化，二级和三级结构的差异与P5CS蛋白一级结构中氨基酸侧基的带电荷量有关。对比3份高羊茅材料及紫花苜蓿P5CS蛋白第68－175位区段氨基酸的带电荷情况，紫花苜蓿带电荷的氨基酸共28个，其中带正电荷的氨基酸13个，带负电荷的氨基酸15个，带正电荷的氨基酸占带电荷氨基酸的46．2%，QC1、QC2n、QC2b中带正电荷的氨基酸所占比例分别为44．8%、41．4%和37．9%，紫花苜蓿P5CS带正电荷氨基酸的比例最大，带负电荷氨基酸所占百分比最小，QC2b的P5CS带正电荷氨基酸所占百分比最小，带负电荷氨基酸所占比例最大（表3）。

表2 QC1、QC2n和QC2bP5CS之间不同的氨基酸位点Table 2 Different amino acid sites in P5CS among QC1，QC2nand QC2b

表3 高羊茅与紫花苜蓿P5CS蛋白第68－175位氨基酸区段带电荷氨基酸的数量比较Table 3 Comparison of charged amino acid amounts from amino acid 68to 175of P5CS between tall fescues and alfalfa

图5 高羊茅P5CS谷氨酸激酶（G5K）结构域的三维结构比较Fig．5 Comparison of deduced three－dimensional structure of G5Kdomain in P5CS protein of three tall fescues

2．3 P5CS酶活性及脯氨酸含量的测定 取干旱处理后3份高羊茅材料的叶片，分别测定P5CS酶活性及其脯氨酸含量（图6）。结果表明，QC1叶片的P5CS酶活性及其脯氨酸含量最高（P＜0．01），QC2b的P5CS酶活性及其脯氨酸含量最低（P＜0．01），QC2n的居中。

3 讨论

本研究以QC1、QC2n、QC2b为3份实验材料，采用RT－PCR方法分别扩增出P5CS基因。与已知序列相比，3个P5CS基因编码的蛋白中均含有谷氨酸激酶功能区和谷氨酰半醛脱氢酶功能区，这两个功能区是高等植物P5CS蛋白的共有结构。说明本研究克隆到的基因的确为P5CS基因并且结构完整。

图6 QC1、QC2n、QC2b叶片的P5CS酶活性及其脯氨酸含量Fig．6 Activities of P5CS enzymes and contents of proline in leaves from tall fescues QC1，QC2nand QC2b

P5CS是谷氨酸合成脯氨酸的关键酶，酶活性的高低直接影响植物脯氨酸的生成量。脯氨酸有助于提高植物的抗逆性［12－13］。对豇豆（Vigna unguiculata）P5CS基因进行定点突变，使第129位氨基酸从苯丙氨酸（Phenylanlanine，Phe）突变为丙氨酸（Alanine，Ala），则P5CS的酶活性和脯氨酸合成量上升［4］。对比3份高羊茅材料的P5CS氨基酸序列，在谷氨酸激酶（G5K）功能区有6个氨基酸不同，其中第37、85及142位氨基酸位于P5CS的第68－175位氨基酸区段，处于ATP结合位点和亮氨酸结构域的中间区域，位于P5CS完整蛋白的外表面。ATP结合位点主要结合ATP，亮氨酸结构域通过拉链结构将P5CS两个功能区相接，以维持P5CS蛋白三级结构的稳定［14］。3份高羊茅材料P5CS蛋白第37、85及142位氨基酸的变异导致这些位点所带电荷发生了变化，3个变异位点正处于亮氨酸结构域的周围，可能因此影响蛋白的三级结构，影响蛋白的酶活性。研究证实，紫花苜蓿的抗逆性强于高羊茅，脯氨酸含量也高于高羊茅［15］。对比3份高羊茅材料QC1、QC2n、QC2b与紫花苜蓿P5CS蛋白的第68－175位氨基酸中带电荷极性氨基酸的数量，紫花苜蓿带正电荷的氨基酸百分比明显高于本研究中的3份高羊茅材料。结合3份高羊茅材料P5CS酶活性及脯氨酸含量的测定结果，以及3份高羊茅材料中QC1的抗旱性最强等研究［16］，推测第68－175位氨基酸区段正电荷氨基酸的数量增加可能提高P5CS的酶活性，增加脯氨酸的合成量，增强植物的抗旱能力；正电荷量下降／负电荷量增加则可能降低P5CS的酶活性，减少脯氨酸的合成量，抗旱能力也随之下降。另外从叶型上看，高羊茅QC1的叶片最窄，QC2n其次，QC2b的叶片最宽。较窄的叶片散热慢，蒸腾失水少［17］，可能也是3份高羊茅抗旱性差异的原因之一。这些研究结果可为转基因高羊茅植株的定向突变提供理论依据，也有助于培育抗逆性更强的高羊茅品种和植物抗逆机理等研究。

致谢：感谢贵州省草业研究所莫本田研究员提供的帮助。

［1］ Isabel P A，Francisco C A，Ana I M，et al．Pyrroline－5－carboxylate synthase and proline biosynthesis：From osmotolerance to rare metabolic disease［J］．Proteins，2010，3：372－382．

［2］ Yoshiba Y，Kiyoshue T，Katagiri T，et al．Correlation between the induction of a gene for P5CSand the accumulation of proline in Arabidopsis thaliana L．under osmitic stress［J］．The Plant Journal，1995，7：751－760．

［3］ Kishor P B K，Hong Z，Miao G H，et al．Overexpression of pyrroline－5－carboxylate synthetase increases proline overproduction and confers osmotolerance in transgenic plants［J］．Plant Physiology，1995，108：1387－1394．

［4］ Hong Z，Lakkineni K，Zhang Z H，et al．Removal of feedback inhibition of delta（1）－pyrroline－5－carboxylate synthetase results in increased proline accumulation and protection of plants from osmotic stress［J］．Plant Physiology，2000，122（4）：1129－1136．

［5］ 刘娟．转基因冰草的生物学性状和抗旱耐盐性研究［D］．呼和浩特：内蒙古农业大学，2007．

［6］ 苏加楷，张文淑，李敏．优良牧草及栽培技术［M］．北京：金盾出版社，2009：127－129．

［7］ 吴佳海，牟琼，罗天琼，等．抗逆高羊茅新品种黔草1号的特征特性［J］．种子，2007（12）：101－104．

［8］ 莫本田，罗天琼，唐成斌，等．牧草新品种黔草2号苇状羊茅的选育［J］．贵州农业科学，2006（4）：79－81．

［9］ Sambrook J，Russell D W．分子克隆实验指南［M］．第三版．北京：科学出版社，2002：518－522．

［10］ Garcia－Rios M，Fujita T，Larosa P C，et al．Cloning of apolycistronic cDNA from tomato encodingγ－glutamyl kinase andγ－glutamyl phosphate reductase［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences U．S．A，1997，94：8249－8254．

［11］ 朱广廉．植物生理学实验［M］．北京：北京大学出版社，1990：249－251．

［12］ Nolte K D，Hanson A D，Gage D A．Proline accumulation and methylation to proline betaine in citrus：Implication for genetic engineering of stress resistance［J］．Journal of the American Society for Horticultural Science，1997，122：8－13．

［13］ 蒋明义，郭绍川，张学明．氧化胁迫下稻苗体内积累的脯氨酸的抗氧化作用［J］．植物生理学报，1997，23：347－352．

［14］ Hu C A，Delauney A J，Verma D P．A bifunctional en

zyme （delta 1－pyrroline－5－carboxylate synthetase）catalyzes the first two steps in proline biosynthesis in plants［J］．Proceedings of the National Academy of Sciences U．S．A，1992，89：9354－9358．

［15］ 汪东．干旱地区高速公路边坡生物防护技术研究［D］．雅安：四川农业大学，2005．

［16］ 罗绍薇，罗天琼，刘正书．3种禾本科牧草抗旱性的初步鉴定［J］．草业与畜牧，2007（11）：17－21．

［17］ Gibson A C．Photosynthetic organs of desert plants［J］．Bioscience，1998，48：911－920．