黄芪水蛭制剂对糖尿病肾病大鼠TGF-β1表达的实验研究*

傅晓骏 熊荣兵

（浙江省金华市中医院，浙江 金华 321017）

黄芪水蛭制剂对糖尿病肾病大鼠TGF-β1表达的实验研究*

傅晓骏△熊荣兵

（浙江省金华市中医院，浙江 金华 321017）

目的 研究黄芪水蛭制剂对糖尿病肾病大鼠TGF-β1表达的影响，探讨其在糖尿病肾病大鼠肾脏的保护机制。方法 采用高脂饲料喂养加STZ腹腔注射制作糖尿病肾病大鼠模型。分为正常对照组、模型对照组、中药治疗组（黄芪水蛭制剂）、雷公藤治疗组（雷公藤）、西药治疗组（洛汀新）、中西药治疗组（黄芪水蛭制剂加洛汀新），观察各组大鼠治疗后血糖变化，并于实验结束前进行留尿，测24 h尿蛋白定量。免疫组化方法测定大鼠TGF-β1的表达。结果 经黄芪水蛭制剂治疗2个月后，各治疗组空腹血糖、24 h尿蛋白定量均明显低于模型对照组。模型对照组TGF-β1表达显著高于各治疗组。结论 黄芪水蛭制剂对糖尿病肾病大鼠的肾保护作用可能与其抑制TGF-β1表达有关。

黄芪水蛭制剂 糖尿病肾病大鼠 TGF-β1雷公藤

△通信作者

Experimental study of Huangqi Shuizhi Preparation on Expression of TGF-β1of Renal Tissue in STZ-in-

糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，常常发展为终末期肾功能衰竭，是影响糖尿病肾病患者生存质量和死亡率的重要因素之一。近年来研究表明，转化生长因子－β（TGF－β）在DN发病机制中占有重要地位［1］，它能直接引起肾脏多种细胞肥大、ECM过度积聚、肾小球硬化、肾间质纤维化等DN特征性病理改变，有学者认为其可能为DN发病机制的最后共同通路。本实验就通过观察黄芪水蛭制剂对糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β1表达的影响，通过与洛汀新、雷公藤的比较，探讨黄芪水蛭制剂对糖尿病肾脏病变的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级SD雄性大鼠 80只，体质量（140±20）g，动物许可证号：SYSK（沪）-2009-0069。

1.2 试药 黄芪水蛭制剂方组成：黄芪、水蛭粉。药物经常规煎煮过滤，浓缩至每毫升含生药2.33 g。洛汀新（盐酸贝那普利片，产品批号：X1377）。雷公藤多苷片 （雷公藤配方颗粒，批号0903136）。链尿佐菌素（STZ），美国Sigma公司生产。兔抗TGF-β1多克隆抗体试剂盒，Abcam公司生产。24 h尿蛋白定量试剂盒，由南京建成生物工程有限公司生产。血糖试纸，强生公司生产。

1.3 分组及造模 SD大鼠适应性饲养1周后，随机取8只为正常对照组，其余为模型组。模型组予高脂饲料喂养，按文献方法腹腔注射STZ，每周1次，连续3周，造模完成72 h后，经尾静脉采血测血糖，空腹血糖大于16.7 mmol/L为糖尿病模型复制成功。1周后留取大鼠即刻尿，测尿微量白蛋白及尿肌酐，模型组的尿微量白蛋白/尿肌酐显著高于正常对照组，即为糖尿病肾病造模成功。将造模成功的40只大鼠随机分为模型对照组、中药治疗组、雷公藤治疗组、西药治疗组、中西药治疗组，每组8只。

1.4 治疗方法 正常对照组、模型对照组分别予以2 mL的蒸馏水灌胃，中药治疗组予黄芪水蛭制剂煎液 （每毫升含生药量2.33 g）2 mL灌胃，西药治疗组予洛汀新（蒸馏水溶解，每毫升含洛汀新0.33 mg）2 mL，中西药治疗组予黄芪水蛭制剂煎液加洛汀新（蒸馏水溶解每毫升含生药量2.33 g，含洛汀新量0.33 mg）混悬液2 mL灌胃，雷公藤组予雷公藤配方颗粒（蒸馏水溶解，每毫升含雷公藤33.3 mg）2 mL灌胃，连续给药2个月。实验期间各组大鼠自由摄食、饮水。

1.5 标本采集及检测 （1）24 h尿蛋白定量。动物灌胃2个月后，即实验结束前1 d，金属代谢笼收集大鼠的即刻尿及24 h尿液，-70℃冰箱保存，待测。24 h尿蛋白定量即严格按照说明书操作完成，由上海曙光医院肾病研究所里测定。（2）空腹血糖。开始用药前及治疗结束后，尾静脉采血，用血糖仪及血糖试纸测定随机血糖，用强生血糖仪进行测定。（3）肾脏组织中TGF-β1的表达。实验结束后处死大鼠，无菌操作取肾，去掉包膜，矢状线正中切开，1/2肾脏用10%甲醛溶液固定，取小块皮质，脱水包埋，行石蜡块4 μm厚连续切片。采用SP法，按照TGF-β1试剂盒操作程序进行免疫组织化学染色。光镜下观察胞质中出现棕黄色颗粒为阳性。用IPP6.0图像分析软件进行分析。

2 结 果

2.1 各组空腹血糖含量比较 统计治疗后各组大鼠空腹血糖的变化结果见表1。与模型组比较，各治疗组空腹血糖均明显下降（P＜0.05），但各治疗组之间比较均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组空腹血糖、24 h尿蛋白定量比较（±s）

表1 各组空腹血糖、24 h尿蛋白定量比较（±s）

与模型对照组比较，*P＜0.05。

组 别 n 空腹血糖（mmol/L） 24 h尿蛋白定量（mg/L）正常对照组 8 7.2500±0.94567* 13.005956±3.7180283*模型对照组 8 32.3750±1.25670 91.770421±14.3294954中药治疗组 8 24.5857±1.98026* 53.419090±24.3501670*西药治疗组 8 26.1000±3.51454* 54.095916±22.1365442*雷公藤治疗组 8 25.5857±1.68026* 50.419090±23.3501670*中西药治疗组 8 23.3250±5.62437* 38.338335±14.1844041*

2.2 各组24 h尿蛋白定量比较 治疗后各组大鼠24 h尿蛋白定量见表1。模型对照组显著高于正常对照组（P＜0.05）；与模型对照组比较，各治疗组均呈明显下降趋势（P＜0.05），但各治疗组之间无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 TGF-β1在大鼠肾组织中的表达 正常对照组大鼠呈弱阳性的表达或没有表达，而与正常对照组相比，模型对照组明显呈强阳性的表达，各治疗组也均有表达，但与模型组比较，表达弱些，呈下降趋势。见图1。

图1 各组肾脏组织切片

3 讨 论

DN属中医学“消渴病”、“水肿”等范畴。其病机为本虚标实之证，气阴两虚为其本，瘀血阻络为其标。笔者认为益气养阴、活血化瘀法为早期糖尿病肾病治疗大法。具体应用黄芪水蛭制剂治疗。方中黄芪味甘性微温，归脾肺经，既能补脾气而升阳，又能补益肺脾气而固表利水，具有补气升阳，水消肿之功。药理研究显示，黄芪能降糖、改善微循环，抗血小板和红细胞聚集，降低血黏度，有利于减轻脂质在肾小球的沉积和清除过氧化物，促进肾小球基底膜的修复，显著减少尿蛋白的排泄［2］。而水蛭是一种传统的破血药，微寒咸腥，善破血瘀，通经脉，利水道。药理研究也表明：水蛭含水蛭素、组胺样物质、肝素、抗血栓素，能阻碍血液凝固，扩张血管，促进血液循环，并有降低动物血清TC、TG，调整前列腺素I2/血栓素B2比值，从而起到使动脉斑块消退的作用［3］。

糖尿病肾病主要病变是肾小球出现以细胞外基质增多为主要特征的系膜区增宽、基底膜增厚，随病情进展可继发肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管基底膜增厚、肾间质单个核细胞浸润及晚期时肾间质纤维化等间质病变［4］。除了血糖、血脂代谢紊乱、血液动力学异常，许多实验和临床资料均提示糖尿病往往存在炎细胞浸润和细胞因子、炎症介质水平上升［5-6］。TGF的高表达，可通过核转录因子-κB（NF-κB）信号通路使MCP-1基因上调及转录增强，因此TGF与MCP-1通过直接或间接的方式相互作用，造成恶性循环，加重了DN的炎症反应，促进了DN的进展。TGF-β1是迄今发现的最强的细胞外基质沉积促进剂，能作用于多个环节，能刺激各种细胞外基质成分的合成和沉积，抑制蛋白水解酶的产生，使细胞外基质沉积进一步增加。因此TGF-β1已被公认为导致细胞外基质积聚的重要生长因子，并且和肾组织硬化密切相关。因而抑制TGF-β1在肾脏的过度表达或阻断其作用是防治或延缓DN发生发展的一条有效途径［7-8］。

本实验显示，黄芪水蛭制剂对糖尿病肾病大鼠有一定的治疗效果，具有一定的肾脏保护作用。黄芪水蛭制剂与雷公藤组比较，虽然没有明显的差异，但与雷公藤效果非常接近，有关研究表明雷公藤多苷片可能通过影响TGF-β1在DN肾组织内的表达而发挥保护肾小管损害的作用，也可能是雷公藤多苷片保护DN肾脏足细胞、抑制系膜增殖甚至减轻肾小球微血管病变的机制之一［9］。与模型组比较，经治疗2个月后黄芪水蛭制剂组的肾组织的TGF-β1表达明显受到抑制。TGF-β1参与了肾脏病理变化，抑制TGF-β1的表达可以延缓糖尿病肾脏的损害，这与文献报道一致［10］。随着TGF-β1表达的下调，蛋白尿明显减少及肾功能得以改善，说明TGF-β1表达的下调与蛋白尿减少、肾组织病理肾功能改善密切相关，推测黄芪水蛭制剂可能通过抑制DN大鼠炎症反应，减少了蛋白尿的发生，延缓了肾功能损害进展。

综上所述，黄芪水蛭制剂对糖尿病肾病大鼠具有改善肾功能的作用，其机制可能与其抑制TGF-β1表达，抑制了DN大鼠炎症反应，减少蛋白尿的发生有关。

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duced Diabetic Nephropathy Rats

FU Xiao-jun，XIONG Rong-bing.TCM Hospital Of Jinhua City，Zhejiang Province， Zhejiang，Jinhua，321017

Objective:To investigate the effect of Huangqi shuizhi Preparation on expression of TGF-β1 of renal tissue in STZ-induced diabetic nephropathy rats,and further explore the mechanism of action of Huangqi shuizhi Preparation on the renal protection in STZ-induced Diabetic Nephropathy Rats.Methods:Fed with high fat diet and STZ produced by intraperitoneal injection in rats with diabetic nephropathy.Rats were randomly divided into six groups:normal control group，model control group，Chinese medicine group （Huangqi shuizhi Preparation group），Leigongtengpian Duo DAI pian group,western medicine group （Lotensin group）and Chinese and Western medicine group （Huangqi shuizhi Preparation and Lotensin group）.Rats were determined after treatment fasting blood glucose.Leave all rats's urine before the end of the experiment.And the 24 hurinary protein was determined.The expression of TGF-β1of renal tissue in STZ-induced diabetic nephropathy rats was measured with immunohistochemical method.Results:After treatment for two months with renal sugar granule,the general situation in rats compared with the model rats were improved better;and the weight also gain significantly.Fasting blood glucose，24h urinary protein in the treatment groups were significantly lower than the model group;and TGF-β1 of Renal Tissue in the model rats showed high expression,respectively significantly higher than every treatment groups.Conclusion:The possible mechanism of the renal protective effect of Leigongtengpian Duo DAI pian on STZ-induced Diabetic Nephropathy Rats is the inhibited expression of TGF-β1in renal tissue in rats.

Huangqishuizhi Preparation；Diabetic nephropathy in rats；TGF-β1；Leigongteng

R285.5

A

1004-745X（2012）10-1595-03

浙江省中医药管理局立项课题（2010ZB155）

2012-05-08）