早期自然流产患者绒毛组织血管生成状况的研究

王为男， 伍招娣

(1.南华大学附一医院妇产科，湖南 衡阳421008;2.中南大学湘雅医院妇产科，湖南长沙421001)

早期自然流产(early spontaneous abortion，ESA)是临床常见的妊娠并发症之一，占全部自然流产的80%以上.ESA病因复杂，涉及遗传、解剖、内分泌、感染及免疫等方面，常为多种因素共同作用所致，发病机制尚未完全明确.本文运用体视学方法测定ESA患者绒毛血管的体视学密度参数，定量反映绒毛血管在三维空间数量和形态的变化，旨在探讨绒毛血管生成状况与ESA发生发展的相关性.

1 临床资料

选取2011年1月至11月在中南大学湘雅医院妇产科门诊及住院部诊治的患者符合条件者45例.流产的诊断标准参照乐杰主编的第7版《妇产科学》，分为流产组(A组、B组)和正常早孕组.各组年龄、孕周、孕次及孕囊平均直径比较无统计学差异(P＞0.05).

2 分组

2.1 研究组

ESA患者30例，根据B超检查结果分为两组:

流产A组15例:B超确诊为宫内早孕活胎，有阴道流血、腹痛等先兆流产临床表现，放弃保胎要求行人工流产术终止妊娠者.

流产B组15例:B超确诊为胚胎停止发育，有或无阴道流血、腹痛等先兆流产临床表现，绒毛膜绒毛染色体核型分析无异常者.

2.2 对照组

正常早孕妇女15例:B超确诊为宫内早孕活胎，无先兆流产临床表现，自愿要求行人工流产术终止妊娠者.

3 实验方法

收集各组患者手术吸刮所得绒毛组织进行免疫组化SP法染色，光镜下观察绒毛组织CD34阳性细胞，利用全自动病理图像分析仪及体视学图像分析软件对切片进行分析，每例标本随机取5张切片，每张切片随机取10个视场，在光镜下(400×)分析视场内所有CD34阳性部位，参照系为绒毛组织，测定参照系内血管数目、周长、截面面积及参照系面积，并通过体视学计算公式分别计算血管体视学密度参数[1]:Lv、Sv、Vv.

4 结果

4.1 统计学处理

采用SPSS 15.0软件分析和处理数据，体视学密度参数用均数±标准差(±s)表示，多样本均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD-t检验，以α=0.05为检验水准，P＜0.05为有统计学意义.

4.2 绒毛组织CD34表达及血管形态

CD34特异性标记血管内皮细胞，阳性细胞胞膜及胞浆被染成棕黄色，CD34阳性细胞聚集形成管腔处为血管，未形成管腔处可能为血管芽.正常早孕组绒毛间质中央及周边可见较多血管分布，以有管腔的血管居多，血管扩张，管腔内可见血细胞;流产A组绒毛间质内血管数量减少，仍以有管腔的血管居多，血管明显扩张，管腔内可见较多血细胞;流产B组绒毛间质内血管数量明显减少，有管腔的血管数量少，管腔狭小，少数血管破裂，血细胞外溢.

4.3 绒毛血管体视学密度参数的比较

流产A组Lv与正常早孕组比较显著降低(P＜0.05)，流产A组Sv、Vv与正常早孕组比较差异无显著性(P ＞0.05);流产 B 组 Lv、Sv、Vv与正常早孕组、流产A组比较均显著降低(P＜0.05).见表1.

表1 各组绒毛血管Lv、Sv、Vv比较(±s)Tab.1 Compare Lv、Sv、Vv of chorionic villus respectively(±s)

表1 各组绒毛血管Lv、Sv、Vv比较(±s)Tab.1 Compare Lv、Sv、Vv of chorionic villus respectively(±s)

*采用单因素方差分析及LSD-t检验.a:流产A组vs正常早孕组P＜0.05;b:流产B组vs正常早孕组 P＜0.05;c:流产 A组vs流产B组P＜0.05

组 别 例数/例长度密度Lv/m(μm/μm3)表面积密度Sv/m(μm2/μm3)体积密度Vv 10－2正常早孕组＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 15 518 ±102 414 ±172 4.10 ±2.19流产 A 组 15 389±80a 419±124 4.21±2.36流产 B 组 15 210±35bc 235±118bc 2.48±2.09bc F 107.783 33.840 10.288 P*

5 讨论

胎盘绒毛血管发育及其网络构建是胎儿与母体进行物质交换的保证，与胎儿的生长及存活关系密切.绒毛血管最初发生于受精后第21天，胎盘雏形形成于受精后第28天(妊娠第6周)，胎盘结构的成熟与功能的完善则完成于妊娠12周以后.从胎盘形成到成熟的过程中，如果绒毛血管发育不良，将直接影响胚胎营养的供给及代谢产物的排出，使胚胎难以存活，导致流产[2]，临床上这段时间自然流产发生较为频繁.

绒毛新生血管在间质内原位分化、形成后，仍不成熟、不稳定，具有很大的可塑性和高渗透性，需经过广泛而持续的改造，才能适应胎儿生长发育的需求[3].形态学研究显示，在妊娠早期，绒毛血管网的形成以分支样血管生成为特征，通过血管侧向出芽及填充式血管生成等方式，形成形态多样的血管.由于分支样血管生成产生了大量并联排列的血管，使血管的节段长度和总血流阻力都降到最低，形成富于分支、低血流阻力的血管[4]，血管总表面积和体积也增大，意味着胎儿血与母血的交换面积增大，血流量增多，使母胎之间跨膜转运物质更多，从而满足胎儿生长发育不断增加的代谢需求.

体视学(Stereology)是由二维结构信息定量推导三维结构信息的科学，可以通过三维和定量的形态学观测去揭示或阐明功能改变的本质[1]，现已应用于生物医学研究中.体视学密度参数是指单位包容空间(体积)中所含结构成分(X相，如血管)的长度、表面积、体积等的大小或多少，其基本特点是以三维空间为基础来衡量结构成分的数量特征.本研究采用体视学密度参数中的长度密度(Length Density，Lv，单位包容空间中X相所占的长度)、表面积密度(Surface Density，Sv，单位包容空间中X相所占的表面积)和体积密度(Volumn Density，Vv，单位包容空间中X相所占的体积)来描述绒毛血管生成状况.相对于二维平面密度(如微血管密度MVD)，体视学密度参数可以从三维水平揭示绒毛血管的空间数量和结构，更准确的反映胚胎及胎儿的血氧供给情况.

本研究发现流产A组绒毛血管Lv低于正常早孕组，Sv和Vv与正常早孕组比较无显著性差异，提示该组绒毛血管在单位体积的绒毛中所占的长度缩短，而所占的表面积和体积无变化，血管呈现短而粗的形态.由此推测其绒毛血管的分支样血管生成减少，血管发生代偿性扩张，尚能维持胚胎的血液供应，胚胎得以存活.因此临床上先兆流产患者在胚胎存活时，通过积极的保胎治疗，绒毛血管生成有可能恢复正常，使妊娠得以继续.如果绒毛血管生成异常缓慢发展，胎儿以减慢生长速率来适应低于正常的营养供应，则可能发展为胎儿生长受限等不良妊娠结局.Huisman MA等发现孕晚期发生妊娠期高血压疾病或胎儿生长受限的孕妇，在孕早期活检的绒毛膜绒毛中已出现血管数量减少，绒毛血管化异常[5]，说明孕早期的绒毛血管生成异常可能影响胎儿以后的生长发育过程.

如果绒毛血管生成进一步减少，血管扩张失代偿，将使绒毛血管 Lv、Sv、Vv都降低(流产 B 组)，即血管长度缩短，表面积和体积都缩小.光镜观察还发现流产B组绒毛间质内有管腔的血管数量少，且管腔狭小，说明其绒毛血管生成数量严重不足，血管分支少，且有管腔的功能性血管减少，使胎儿血与母血之间的物质交换面积减少，血流量下降，胚胎失去营养支持，停止发育，从而发生流产.Hakvoort RA等运用CD34免疫组化、人工计数方法，对早孕绒毛膜绒毛的血管化进行组织学分类，发现胚胎死亡病例绒毛血管系统存在轻度至重度发育不全，绒毛内血管数量明显减少，且有管腔的血管数量减少[6].这与本研究结果一致.

我们研究发现，流产组从胚胎或胎儿存活到死亡，绒毛血管首先在三维空间内长度缩短，然后发展为血管表面积和体积缩小，血管网形态和结构发生异常，使胎儿—胎盘单位灌注不足，胚胎或胎儿缺血缺氧，以致停止发育而死亡，从而导致流产发生.由此，我们认为绒毛血管生成异常可能参与了早期自然流产的发生发展过程.如何对胎盘血管生成过程进行调控，可能预防和治疗一部分自然流产患者，还需要进一步的体内、外实验研究.

[1] 申 洪，沈忠英.实用生物体视学技术(第一版)[M].广州:中山大学出版社，1991.

[2] Torry DS，Hinrichs M，Torry RJ.Determinants of placental vascularity.[J].Am Reprod Immunol，2004，51(4):257-268.

[3] Burton GJ，Charnock-Jones DS，Jauniaux E.Regulation of vascular growth and function in the human placenta.[J].Reproduction 2009，138(6):895-902.

[4] Kaufmann P，Mayhew TM，Charnock-Jones DS.Aspects of Human Feto-placental Vasculogenesis and Angiogenesis.II.Changes During Normal Pregnancy.[J].Placenta 2004，25(2-3):114-126.

[5] Huisman MA，Timmer B，Stegehuis J，et al.Vascularization in first-trimester chorionic villi in complicated and uncomplicated pregnancies.[J].Am J.Obstet Gynecol 2010，202，88:1-7.

[6] Hakvoort RA，Lisman BA，Boer K，et al.Histological classification of chorionic villous vascularization in early pregnancy.[J].Human Reproduction 2006，21(5):1291-1294.