抗冻蛋白的作用机制及基因工程研究进展

汪少芸， 李晓坤， 周焱富， 吴金鸿

(1.福州大学生物科学与工程学院，福建福州 350002;2.上海交通大学生物与食品学院，上海 290002)

抗冻蛋白的作用机制及基因工程研究进展

汪少芸1， 李晓坤1， 周焱富1， 吴金鸿2

(1.福州大学生物科学与工程学院，福建福州 350002;2.上海交通大学生物与食品学院，上海 290002)

分析了抗冻蛋白的作用机制及基因工程的研究进展.抗冻蛋白是一类具有热滞效应、冰晶形态效应和重结晶抑制效应的蛋白质.近些年的工作主要集中在该类蛋白质抗冻机制及基因工程的研究上.抗冻蛋白具有广泛的应用前景，它不但可以应用于食物的冷鲜贮存及移植器官的低温保存，还可通过转基因提高经济作物的抗冻能力.

抗冻蛋白;作用机制;基因工程

抗冻蛋白 (antifreeze protein，AFPs)是一类能控制冰晶生长和抑制冰晶之间发生重结晶的蛋白质，能在结冰或亚结冰条件下保护生物体不受伤害.抗冻蛋白具有两种明显不同的活性——热滞活性和重结晶抑制活性.抗冻蛋白虽然在氨基酸序列、物种来源和高级结构等方面具有很大差异，但都能通过吸附作用与特定冰晶表面结合，从而表现出相应的抗冻活性.它或者通过与冰晶结合而影响冰晶的形状及大小来发挥作用.基于抗冻蛋白影响冰晶结构的特性，对抗冻蛋白的最新定义是“Ice structuring protein”，即制约冰晶结构的蛋白质［1］.生物体细胞间隙中的抗冻蛋白通过与冰结合、修饰冰晶形态、阻止冰晶进一步生长来保护生物体免受冻伤，抗冻蛋白的应用除了在低温保护、霜冻保护方面，还可以作为生物矿化的模型［2］.不同来源的抗冻蛋白无论结构或活性都存在着很大的差异，其抗冻机理/学说也不完全一致，阐明抗冻蛋白的作用机制对研究者来说仍然是一个巨大挑战.本文试总结近年来对抗冻蛋白的作用机制/学说及基因工程的研究进展.

1 抗冻蛋白的作用机制

至今，在鱼、昆虫、植物和细菌等生物体中发现抗冻蛋白，按照来源的不同，抗冻蛋白被分为鱼类抗冻蛋白、昆虫抗冻蛋白、植物抗冻蛋白和细菌抗冻蛋白［1］.从鱼、昆虫、植物以及细菌中分离的抗冻蛋白的结构和组成上具有很大的差别，不同抗冻蛋白的抗冻机理不完全一致.鱼类抗冻蛋白的研究较多，而植物和昆虫抗冻蛋白的作用机制研究甚少.

抗冻蛋白能结合在水和冰的交界面来抑制冰晶的生长.但不同类型的抗冻蛋白能结合的冰面类型不同［3］.作为表面活性物质，少量AFPs能对冰的生长产生巨大影响.AFPs是如何与冰晶结合的呢?

1.1 吸附抑制学说

吸附抑制学说最早由Raymond和Devires在1977年提出.他们认为抗冻蛋白吸附在冰晶表面通过Kelin效应抑制其生长.机制的模型为:一般晶体的生长垂直于晶体的表面，假如杂质分子吸附于冰生长通途的表面，那么需要在外加一推动力(冰点下降)，促使冰在杂质间生长.由于曲率增大，使边缘的表面积也增加.因表面张力的影响，增加表面积将使体系的平衡状态发生改变，从而冰点降低［4］.抗冻蛋白积累在冰和水的接触面，通过改变冰晶的形成和生长方式来修饰冰晶生长.

抗冻糖蛋白的二糖链上富含羟基，各羟基之间的距离与冰晶a-轴上氧之间的距离吻合;在不含糖的抗冻蛋白中的极性氨基酸距离也恰好吻合.因此判断，由于抗冻蛋白侧链上的氢键与冰晶结合，通过屏障和覆盖作用阻止冰晶生长.而很多实验也验证了抗冻蛋白和冰晶之间确实有氢键存在［5］.

新加坡国立大学研究人员将小冰晶成核技术应用于AFPⅢ的抗冻机制研究，发现AFPⅢ可以吸附到小晶核和尘埃颗粒上，从而阻碍冰晶的成核作用，使之首次从数量上来检测AFP的抗冻机制［6］.该实验验证了吸附抑制学说的合理性.

在研究抗冻植物抗冻活性时，有学者认为抗冻植物形成了一种特殊的控制胞外冰晶形成的机制，即抗冻蛋白和冰核聚物质的协同作用.在植物体内，热滞效应并不明显，而冰重结晶抑制效应显著.吸附抑制学说是否适应于植物有待进一步证实［7］.

1.2 “晶格匹配”模型

“晶格匹配”模型由DeViles在1983年提出.在“晶格匹配”模型中，冬季比目鱼AFP-I的两亲性α螺旋通过规律排布，突出螺旋外的Thr和Asx残基与冰晶棱面相结合.在这个特异的冰晶结合棱面“晶格匹配”模型被鉴定后，发现该模型似乎也可适用于部分其他的冰晶表面［8］.

加拿大Queen大学的研究人员利用X射线晶体衍射等方法获得了TmAFP的晶体结构后，进行抗冻机制的研究，给出的机制模型为:在TmAFP三棱镜样结构的一个侧面上Thr-Cys-Thr模体重复出现在每一个β片层(三角形的边)中使得Thr在二维空间上排成两行，并且这两行Thr上羟基氧之间的距离可以极好地与冰的晶格匹配，它们的紧密结合阻止了水与冰晶的接触，从而抑制冰晶的增长［6］.

1.3 “偶极子-偶极子”假说模型

“偶极子-偶极子”假说模型由Yang等在1988年提出.该模型认为AFPs有显著平行于其螺旋轴亲水基团和疏水基团的偶极子(dipole).冬季比目鱼的AFPⅠ是一种单一的α螺旋，在冰晶中也存在着偶极子.“偶极子-偶极子”假说就是AFPⅠ的偶极子与冰核周围水分子的偶极子相互作用，即螺旋产生的偶极子作为AFPs与冰晶相互作用的特异识别的起始推动力，两亲性的α螺旋经亲水侧链的定位，提供冰格相互作用的氢键，而疏水侧链则阻止冰晶的生长［8］.“偶极子-偶极子”假说模型很形象地表述了抗冻蛋白和冰晶的作用方式，也为研究抗冻蛋白的作用机制提供了新思路.

1.4 “晶格占有”模型

“晶格占有”模型由Knight等在1993年提出.该模型是在“晶格匹配”模型基础上演变而来.“晶格占有”模型中，AFPs中部分氢键基团通过“占有”冰晶表面上氧原子的位置，从而与临近的氧原子同时形成了多个氧键，这样就使得氢键数量增加了几倍，最终导致AFPs冰晶之间形成不可逆结合［8］.

1.5 氢原子结合模型

该模型认为，AFPs分子一侧相对疏水，另一侧是亲水的，亲水一侧与冰相结合，而疏水一侧与水相作用.从鳗鱼(macrozoarces americanus)中提取的AFPⅢ的0.125 nm晶体结构揭示有一明显两性冰结合位点，在那里相连有5个氢原子和在冰柱面(prism plane)的两列氧原子相匹配，有很高冰结合亲和性和专一性.每个AFP分子14个非丙氨酸侧链或有利于与冰结合，或有利于螺旋的稳定性.AFPs在晶体内所呈现的精巧的帽子结构大大增强这种稳定性.N-末端帽子结构是由8个氢原子(Asp1，Thr2，Ser4，Asp5 和两个水分子的氢)组成的有序网.帽子结构内部Asp1能增加冰晶与螺旋偶极子作用的稳定性.同时与游离N-端最近的Asp5也可以抵消与螺旋偶极子作用的不稳定性变化［9］.

AFPs-冰结合结构由苏氨酸/门冬氨酸，苏氨酸/天冬酰氨/亮氨酸重复序列组成4个相似的冰结合模块(ice-binding motifs，IBM).IBM残基牢牢限制形成例外的扁平冰结合面，对AFPs-冰结合群接近影响重大.这关键在于苏氨酸和天冬氨酸或天冬氨酸之间保守的丙氨酸维持.和冰结合平面是“岭-谷”式拓扑结构.AFPs-冰结合面相对扁平和链的刚性是AFPs-冰结合机制的关键.后者维持AFPs分子结合的一致性，前者使得AFPs与冰表面结合的可能性最大.总之，AFPs结构的特征有利于冰的结合和螺旋的稳定性［9］.这正是由于AFPs分子与冰的结合阻止冰晶生长，抗冻蛋白作用得以发挥.

1.6 刚体能量学说

该学说把AFPs分子视为小粒子，因此，根据界面能量原理可以认为AFPs在冰水表面处于平衡位置，并且冰晶的生长过程可以用粒子相互作用的理论观点来解释.在这里，重要的参数是“抗冻蛋白-冰”和“抗冻蛋白-水”界面之间表面能的差异，所用的原则是总表面能最小原理.因此，即使两种界面表面能一样，AFPs分子与冰水无优先结合，当抗冻分子存在时，由于冰-水表面积缩减，AFPs也能强烈吸附冰晶.另外，AFPs必须与冰晶相匹配，否则水分子就会扩散至界面，随着冰晶的增长同时使蛋白向前推进，水分子在粒子后扩散，推进粒子向前，在溶液中形成冰晶体.通过这种方式，即使超过过冷却温度1℃或更小，也会产生很大的压力.在有AFPs的溶液中，因为一系列的抗冻蛋白分子永久性地锚定于冰上，所以它们就不可能被向前推进.这样，只有当过冷却水足以吞没AFPs分子时，冰晶才能形成.这就有效地阻止冰晶的形成［9］.

1.7 “表面互补”模型

“表面互补”模型理论是另一种可以较好解释AFPs抗冻机理的模型，被称为“受体-配体”模型，其中AFPs是受体，冰是配体［10］.该理论认为，AFPs冰晶结合位点所形成的表面与冰晶表面互补.互补表面受多种相互作用力影响，主要是疏水作用和范德华力，氢键起次要作用.较强的表面作用力使AFPs和冰晶形成不可逆的结合，阻止了冰晶生长［11］.

该模型成功地解释了目前已经发现具有极大差异性的AFPs能与不同形状的冰晶表面结合，另一个原因是冰晶含有许多不同的表面，每个表面的拓扑结构和氧原子间距都不相同，AFPs在与任何一个冰晶表面结合后都将阻止冰晶的生长.冰晶就像配体一样，通过表面互补选择性地与不同受体的AFPs结合，这种表面互补方式可适用于所有AFPs［11］.

加拿大阿尔伯达大学的研究人员利用核磁共振方法研究Thr侧链的柔韧性时发现在接近冷冻温度时，在AFPs-冰晶结合面处的Thr以最适与冰晶表面相咬合的构型存在，非结合面处的Thr以多种构型存在.因此得出结论:规则的Thr排列使AFPs与冰晶表面紧密吻合，这种形态互补结合是抑制冰晶生长的关键［6］.该结论证实了“表面互补”理论.

加拿大Queen大学的研究人员利用定点突变的方法测定了AFPⅠ和LpAFP的与冰晶结合面.结果表明，改变冰结合面的氨基酸后，AFPs的抗冻活性大大降低，而改变非结合面的氨基酸，对AFPs的抗冻活性影响不大.该结论进一步证明了AFPs和冰晶面的互补性和专一性［12］.

从我国胡萝卜栽培品种中克隆的DcAFP的理论三维结构为一个非常有规律的右手β螺旋，螺旋的每个β环由LRR基序的24个氨基酸残基组成，其结构特征主要为由保守的L(包括I)组成的疏水核心和保守的P和G组成的β转角.在24aa基序中保守N的两侧为亲水性很强的氨基酸密集区，形成一个高度亲水性表面，与冰晶表面刚好形成不完全互补.DcAFP的LRR基序中高度保守的N端对于维持这个冰晶结合表面具有决定性作用［11］.

不同植物AFPs虽在DNA和氨基酸水平上完全不同，几乎没有同源性，但却拥有相似的高级结构，冰晶结合位点也有一定相似性，都可以通过“表面互补”模型较好地解释其与冰晶的相互作用.但植物AFPs的“表面互补”模型存在很多问题，如至今无法确定“表面互补”模型中到底含有多少种作用力，每种作用力的贡献和作用方式更需进一步研究［13］.

1.8 亲和相互作用偶联团聚模型

浙江大学提出了AFPs在超低温保存机制的新模型，即亲和相互作用偶联团聚模型.该模型认为抗冻蛋白不仅与冰晶作用，而且又与细胞膜和冷冻保护剂中的其他分子发生亲和相互作用.抗冻蛋白在结合冰晶后所暴露的疏水面能够与细胞膜磷脂双分子层发生相互作用.事实上，能够和抗冻蛋白或抗冻蛋白-冰晶复合体发生相互作用的分子广泛存在.研究表明，Ⅱ型抗冻蛋白是从C类动物凝集素的碳水化合物识别区演化而来，后者可结合细胞膜上的糖蛋白.体外实验证明，抗冻蛋白活性可通过一系列低分子化合物来增强或减弱.一种含有碳水化合物的细菌抗冻蛋白，既具抗冻活性，又具冰核活性;去除碳水化合物部分，冰核活性也随之消失.

当抗冻蛋白-冰晶复合体与其他分子的亲和相互作用达到一定程度时，抗冻蛋白-冰晶复合体就团聚起来，从而使冰核变大，表面自由能降低，冰晶生长被促进，抗冻蛋白呈破坏作用;反之，若亲和相互作用小，抗冻蛋白-冰晶复合体不团聚，抗冻蛋白仅起到抑制重结晶的作用，它有利于超低温保存.按照这个模型，冷冻保护剂的组成和浓度，降温和复温速度，抗冻蛋白类型和浓度，最初冰核数目，以及被冻细胞表面特征等等，都可能影响了亲和相互作用的强烈程度［14］，从而影响了抗冻活性.

2 抗冻蛋白的基因及基因工程研究

2.1 抗冻蛋白的基因研究

研究发现，AFPs是被多基因家族编码的.对鱼类AFPs基因的研究比较深入，它们都是串联重复的多基因家族.抗冻糖蛋白(AFGPs)基因序列中结构基因是46个正向串联的同源性片段，每个片段编码一个AFGP和三肽内含子.大多数能够产生AFPs的生物体内并不只有单一的分子结构，而是有一组异源分子同时具有抗冻活性.Andorfer等从12月份的甲虫(dendroides canadensis)幼虫的cDNA文库中，分离到了10个可能的AFP基因，说明这种AFP也是由多基因簇编码的［15］.

有些AFP基因在生物体内以多拷贝存在，最多可以达到100个以上.经研究证明冬鲽单倍体基因中约含40个AFP基因拷贝.其中2/3是正向串联重复排列，每个重复序列中含有一个AFP基因，几个AFP基因的转录方向均相同;其余1/3也是相连的，但被不规则的间隔区分开.纽芬兰大洋条鳕(macrozoarces americanus)的基因组中约含有150个拷贝的AFPⅢ基因，狼鱼(anarhichas lupus)基因组中也有80～85个拷贝的AFPⅢ基因，其中含有许多不规则相连的基因和较大的串联重复.

AFPs在生物体内的表达受发育时期的调控或随温度和季节变化的影响而改变，这种特性为生物在冰冻环境中获得尽可能多的AFPs提供了遗传学基础.研究证明从夏季到冬季AFPs及其mRNA的量可以成倍地增加.冬季比目鱼肝型AFP的mRNA量可以达到夏季量的几百倍，肾和鳍中AFP的mRNA量有5～10倍的变化［16］.云杉色卷蛾幼虫(choristoneura fumiferana)AFP转录主要受发育时期的调控，而不是受季节性低温调控［17］.

2.2 抗冻蛋白的基因工程研究

AFPs具有抗寒性，随着生物技术的发展和广泛应用，利用基因工程将AFP基因转入其他生物以使其具有抗冻性一直是科学研究的一个重要方向.

2.2.1 鱼类抗冻蛋白基因工程

AFPs的转基因实验开始于1986年［18］，Fletcher等将北美黄盖鲽AFPⅠ注入红鳟鱼体内，发现受试红鳟鱼可耐受到－1.4～1.6℃，且AFP没有受体种属特异性.随后Fletcher等［19］将北美黄盖鲽AFPⅠ基因转入南极鲑鱼中，长达5年的表达说明南极鲑鱼能够正确表达插入的北美黄盖鲽AFPⅠ基因，但分泌在血液中AFP前体缺乏必要的酶系统而不能产生成熟的AFP分子.1987年Davies等用叶圆片法将整合在Ti质粒上的美洲拟鲽AFPs基因导入郁金香、烟草、油菜中，并获得了一定的抗冻力［20］.1989年Cutler［21］等用真空透析法将冬比目鱼AFP基因导入马铃薯、拟南芥和油菜中，使植物自然结冰温度降低1.8℃，证实了转AFP基因可提高植物的抗寒性.1990年 Ceorges［22］合成冬比目鱼 AFP基因，构建了含35S启动子、AFP基因和 Cat基因(CAT氯霉素酰基转移酶)的载体pGC51，通过电击法将该质粒导入玉米原生质体，经CAT分析，AFP和CAT的抗血清蛋白质免疫印迹，检测到融合肽的产生.1991年Hightower等［23］将极区鱼的AFP基因(cafa3)由农杆菌介导转入烟草和番茄，据报道这种转基因番茄有很强的冷冻耐受性，已进行大田实验.1995年金海翎等［24］将构建的美洲拟鲽抗冻肽基因表达载体导入E.coli中，检测到了融合基因.AFP基因在原核生物E.coil表达具有重大意义，可通过规模化生产的实现而制作一种高效的生物防冻剂.1997年Wallis等［25］合成 PHA-AFP基因(PHA 植物凝集素)，以农杆菌介导该基因转入马铃薯，对马铃薯叶片电解质释放量的分析表明，转基因的蛋白质表达水平与冰冻忍耐程度之间存在着相关性.

2.2.2 昆虫抗冻蛋白基因工程

越冬昆虫与鱼类相比，面临着更严峻的冰冻威胁，因此昆虫AFPs活性比鱼类更高.1997年Graham［26］等发现黄粉甲虫(tenebrio molitor)AFP 活性比鱼类要高100倍.因此很多人开始尝试将昆虫AFP基因导入植物中，培育抗寒植物新品种.2000年 Liou 和 Graether等［27－28］破译了两种昆虫 AFP 的精确结构，该AFP具有特殊的β-螺旋结构，使有些昆虫能够抵抗－30℃，比鱼类的AFPs还要有效100倍，这个发现将有可能应用于开发高抗寒性植物，并且还可能成为冷冻食品加工业的突破.2001年Holmberg［29］等采用引物重叠延伸法，将云杉蚜虫sbwAFP基因组成 CaMV35S-sbwAFP-胭脂碱合成酶融合基因，采用T-DNA双元载体导入烟草中，通过RT-PCR检测到sbwAFP的转录，含AFP组织提取物具有重结晶抑制效应和热滞效应.2005年刘忠渊等［30］根据 Genbank中序列人工合成赤翅甲(dendroids canadensis)AFP基因，将其克隆到载体pGEX-4T-1上，构建融合表达的重组质粒，转化大肠杆菌BL21并进行原核表达.AFP的生物活性检测表明，赤翅甲的抗冻融合蛋白能够提高细菌的耐寒能力.

最近几年多种表达载体和宿主菌被用来表达昆虫AFPs，酵母表达系统也被用来表达富含二硫键的昆虫AFPs［31］.但是到目前为止还没有活性AFPs的高产表达系统，因此采用基因工程技术获取昆虫AFPs仍是需要解决的问题.

2.2.3 植物抗冻蛋白基因工程

低温冷害不仅会限制农作物的栽种范围，也会造成农作物减产，利用AFP基因工程是使植物获得抗寒性最有效的途径，而率先进入该领域的基因为极区鱼类AFP基因.因为鱼类、昆虫和植物在分类学上的关系遥远，外源基因的正确表达有一定困难，转基因植物中即使表达了较高浓度的有活性的AFPs，转基因植物可能仍无抗冻活性.植物内源AFPs基因更适合在植物体内表达，因此人们寄希望于植物AFP基因的发现和利用.

1992年，加拿大 Griffith等［32］首次报道从经过低温锻炼可忍受细胞外结冰的冬黑麦中发现植物内源性AFPs，标志着植物AFPs研究的开始.1998年英国York大学Worrall等［33］发表了胡萝卜AFP及其基因的论文，标志着第一个植物AFP基因的发现，对于植物抗冻基因工程具有重要意义.他们测定了胡萝卜AFP的体外热滞值及重结晶抑制活性，将其cDNA连接在表达载体的双CaMV35S启动子之后导入烟草，获得正确表达，转基因烟草匀浆液的热滞值为0.35℃.胡萝卜AFP及其基因的发现，为植物抗寒基因工程注入新活力.1999年，Meyer等［34］用农杆菌介导胡萝卜AFP基因重组子转化拟南芥，诱导一系列低温调节蛋白的表达，使未经低温驯化的植株具有较强抗寒能力.2001年尹明安［35］构建成胡萝卜AFP的植物表达载体pBAF，为利用其转化番茄、甜椒等作物奠定实验基础.

3 结束语

近期研究中，人们构建成不同表达载体，将胡萝卜、雪莲、沙冬青、冬小麦等的AFP基因转入烟草和拟南芥等，已研究能产生AFPs的植物虽多达几十种，但真正被分离纯化出来的AFPs尚不多，植物AFPs的生理生化性质、空间构型、作用机制仍不甚清楚，且绝大多数植物材料中AFPs活性大大低于鱼类和昆虫.因此，如何从植物中分离出更多的、活性更高的AFPs，并对其结构、功能进行鉴定、比较分析，深入阐明AFPs的抗冻机制，将是今后植物抗寒性研究的重点.据报道冬季常绿乔木北海道黄杨能忍耐－23.9℃低温，若能从中提取抗寒基因并转入其他植物，无疑将极大提高转基因植株抗寒性.

AFPs是由多基因控制的，而且还与其他环境因子胁迫发生交叉作用，使得植物抗寒机制的研究更具复杂性.因此，在进行植物抗寒性基因工程研究时，应综合考虑各种环境胁迫之间的相互作用以及基因的转入对植物抵抗外界逆境综合适应性的影响，分离纯化AFP基因、重要抗冻因子的基因(包括AFPs转录因子基因及AFPs活化蛋白基因)以及其他多种功能基因，将这些基因进行共转移，进一步拓宽抗寒基因的来源，才能为今后植物抗寒性分子改良开辟新的途径，为培育抗寒新品种奠定基础.

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(责任编辑:檀彩莲)

Research Progress in Antifreeze Machanism and Genetic Engineering of Antifreeze Protein

WANG Shao-yun1， LI Xiao-kun1， ZHOU Yan-fu1， WU Jin-hong2
(1.College of Biological Science and Engineering，Fuzhou University，Fuzhou 350002，China;2.College of Biology and Food Science，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 290002，China)

Antifreeze proteins(AFPs)are the thermal hysteresis proteins that have the ability to modify the growth and inhibit the recrystallization of the ice.Antifreeze proteins aroused great interests of many researchers due to its special structure and functions.Recent studies are focused on their antifreeze mechanism and genetic engineering in attempts to better understand how exactly AFPs work.AFPs have wide applications.They can aid in the food storage and transplant organ cryopreservation，also by transgene they could enhance the antifreeze ability of crops.This article reviewed the recent advance in its antifreeze mechanism and genetic engineering.

antifreeze proteins;mechanism of action;genetic engineering

TS201.2

A

1671-1513(2012)02-0058-06

2011-04-29

国家自然科学基金资助项目(31071498;31000814);留学回国人员启动基金项目(819129);福州大学科技发展基金项目(2009XQ18).

汪少芸，女，教授，博士，主要从事食品生物化学方面的研究.