高效液相色谱法检测酸牛乳中纳他霉素含量的几种前处理方法比较

巩 强 李 波 田 夏

（山西省食品质量安全监督检验研究院，太原 030012）

·食品分析·

高效液相色谱法检测酸牛乳中纳他霉素含量的几种前处理方法比较

巩 强*李 波 田 夏

（山西省食品质量安全监督检验研究院，太原 030012）

在酸牛乳基质中分别添加0.64 mg/L、1.28 mg/L、3.2 mg/L、6.4 mg/L、12.8 mg/L5个浓度的纳他霉素标准品。分别用几种方法进行了酸牛乳样品前处理，高效液相色谱仪测定，外标法定量。比较了几种方法的回收率、检出限及通过滤膜难易程度。结果表明：方法的回收率为66%～103%，检出限为0.02 mg/kg～0.03 mg/kg。

纳他霉素；前处理方法；比较

纳他霉素（Natamycin），也称游链霉素，是一种天然的多烯大环内酯类抗生素，是由纳塔尔链霉菌（Streptomyces Natalensis） 经过发酵得到的一种次级代谢产物。他微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸及二甲苯甲酰胺，难溶于大部分有机溶剂，在pH值高于9或低于3时，其溶解度会有所提高，在大多数食品的pH范围内非常稳定，是一种天然、广谱、高效安全的酵母菌及霉菌等丝状真菌抑制剂。它不仅能够抑制真菌，还能防止真菌毒素的产生。纳他霉素对人体无害，很难被人体消化道吸收，而且微生物很难对其产生抗性，同时因为其溶解度很低等特点，通常用于食品的表面防腐。纳他霉素是目前国际上唯一的抗真菌微生物防腐剂。1997年我国卫生部正式批准纳他霉素作为食品防腐剂。至今该产品已经在50多个国家得到广泛使用，主要应用于乳制品、肉制品、发酵酒、饮料果汁、方便食品、烘烤食品等的生产和保藏。

纳他霉素的测定方法主要有生物效价法、微孔板生物检测法、紫外分光光度计法、元素分析法、比色分析法、薄层色谱法和液相色谱法等。生物效价测定法对实验环境因素（温度等）、材料因素（培养基等）、操作技术等条件要求高，操作过程也比较繁琐；微孔板生物检测法适用大批量的发酵液或样品的检测；紫外分光光度法一般用来做纳他霉素检测的常规对照，若将其用于定量分析，对实验条件要求比较高；元素分析法、比色分析法和薄层色谱法主要用于纳他霉素的定性分析；高效液相色谱法多集中于高纯度纳他霉素产品及食品中纳他霉素残留量的检测分析，是一种行之有效的检测手段。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

安捷伦1260高效液相色谱仪；KQ5200 DE型超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；ELITIST 21K-R型离心机，长沙鑫奥仪器仪表有限公司；WH-2型漩涡振荡器，江苏城西晓阳电子仪器厂。

水为去离子水；甲醇为色谱纯；滤膜，孔径0.45 μm；纳他霉素标准品，纯度大于99.0 g/100 g；亚铁氰化钾溶液，10.6 g/100 g；乙酸锌溶液，21.9 g和3 mL乙酸用水定容至100 mL。

1.2 标准溶液配制

准确称量适量标准物质，用甲醇溶解并定容，配制成0.16 mg/mL标准溶液，4℃保存。根据需要用甲醇配制标准工作溶液。

1.3 样品处理方法

方案一：称取酸牛乳5.00 g（精确到0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入15 mL甲醇，超声提取30 min，加水定容至25 mL，摇匀，冰箱冷冻1 h。取样液过孔径0.45 μm滤膜，进行液相色谱分析。

方案二：称取酸牛乳5.00 g（精确到0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入甲醇15 ml，用水定容至25 mL，摇匀，超声提取30 min，6000 r/min离心10 min。取样液过孔径0.45 μm滤膜，进行液相色谱分析。

方案三：称取酸牛乳5.00 g（精确到0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入沉淀剂亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各1 mL，甲醇定容至25 mL，摇匀。取样液过孔径0.45 μm滤膜，进行液相色谱分析。

方案四：称取酸牛乳5.00 g（精确到0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入沉淀剂亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各1 mL，甲醇定容至25 mL，摇匀，超声提取30 min，6000 r/min离心10 min。取样液过孔径0.45 μm滤膜，进行液相色谱分析。

方案五：称取酸牛乳5.00 g（精确到0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入沉淀剂亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各1 mL，甲醇定容至25 mL，摇匀，超声提取30 min。取样液过孔径0.45 μm滤膜，进行液相色谱分析。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：资生堂CAPCELL PAK C18 MG，250 mm×4.6 mm（i.d），5 μm；柱温：25℃；流速：1.0 mL/min；等度洗脱；流动相：甲醇、水、乙酸体积比为60∶40∶5；检测波长：305 nm；进样量：10 μL。

2 结果与讨论

方案一：优点是回收率高，回收率为100%～103%；缺点是上机前通过滤膜非常困难。

方案二：优点是回收率高，回收率为100%～103%；但仍然不能解决通过滤膜难的问题。

方案三：优点是通过滤膜容易，但回收率仅为66%～68%。

方案四：优点是通过滤膜容易，但回收率为74%～76%。

方案五：优点是通过滤膜容易，但回收率为80%～88%。

经分析，采用沉淀剂和离心方法可以使酸牛乳中蛋白质和脂肪组织结块，有利于去除杂质，但随之纳他霉素的回收率会显著降低；再加以超声提取，能较好地提高回收率；冷冻方法去除脂肪的效果似乎不明显，在实际检测过程中，给过滤膜带来很大困难，同时也对液相色谱仪的保护不利。5种方案所添加的最大浓度梯度范围内均呈线性；5种方案的相关系数和相对标准偏差差异不显著，但均能达到分析要求。

采用仪器自带的软件进行信噪比分析、推算，证实以上5种方案的检出限为0.02mg/kg～0.03 mg/kg。这比GB/T21915-2008报道的0.5 mg/L要低。

3 小结

离心和加沉淀剂对去除酸牛乳杂质和样液通过滤膜都非常有效，但会降低回收率。冷冻去杂的方法效果不明显，样液通过滤膜非常困难，不利于仪器的维护，但回收率较高。在具体的检验过程中可随需要进行选择。

［1］ 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T21915-2008国家标准——食品中纳他霉素之测定液相色谱法［S］.北京：中国标准出版社，2008.

Comparison ofpretreatment methods in determination ofnatamycin content in sour Milk by HPLC

GONGQiang*LI BoTIANXia
（Food qualitysupervision and inspection research institute ofShanxi province，Taiyuan 030012，China）

Differentconcentrationsofnatamycinstandards （0.64mg/L，1.28mg/L，3.2mg/L，6.4mg/L，12.8mg/L）were added in sour milk.Several methods were used tothe pretreatment ofsour milk samples.Theyare assayed byHPLC and quantitative determined by external standard method.Recovery rate，detection limit,and the difficulty degree of filtration membrane were compared.Results showed that the recovery rate was between 66%～103%and the detection limit was 0.02 mg/kg～0.03 mg/kg.

natamycin；pre-treatment method；comparison

TS262.6

A

1673-6004（2012）02-0046-02

* 巩强，男，1978年出生，2004年毕业于山西农业大学生物化学与分子生物学专业，硕士，工程师

2012-03-20