啤酒花潜隐类病毒研究进展

郭立新，徐 颖，蔡曹盛

（北仑出入境检验检疫局，浙江 宁波 315800）

啤酒花（Humulus lupulus）又称酒花、蛇麻花、酵母花等，属桑科多年生蔓性草本植物，是制造啤酒的关键原料[1]。目前，世界上已报道的啤酒花类病毒有3种，即：啤酒花潜隐类病毒（Hop latent viroid，HpLVd）、啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid，HpSVd）和苹果皱果类病毒（Apple fruit crinkle viroid，AFCVd）[2]，其中啤酒花潜隐类病毒是发生最普遍的一种潜隐类病毒。

1 分布与危害

啤酒花潜隐类病毒隶属于Cocadviroid属，分布于英国[3-5]、德国[6]、韩国[7]、波兰[8]、日本[9]、捷克[10]、巴西[11]、美国[2]、中国新疆[12]等国家和地区的啤酒花上。该类病毒侵染啤酒花后不表现明显的症状，但感染Omega品种后出现萎黄、生长缓慢等现象[3,13~14]。当啤酒花受该类病毒侵染后，一些次生代谢产物成分发生改变，从而影响啤酒花品质，降低啤酒花产量。Adams等[4]报道，不同啤酒花品种受HpLVd侵染后，a-酸的含量降低20%～50%；受HpLVd侵染的啤酒花球果产量降低11%[3]。

2 生物学特性

啤酒花潜隐类病毒寄主范围较窄，仅侵染啤酒花（Humulus lupulus）、葎草（Humulus japonicus）和异株荨麻（Urtica dioica）[2,6]。且该类病毒在啤酒花不同组织中含量有差异，同一植株球果中含量最高，其次是叶片，再次是种子，花粉中含量最少[13,15]。HpLVd没有草本寄主植物，黄瓜、西红柿、菊花（Chrysanthemum）、冬瓜（Benincasa hispida）、紫鹅绒（Gynura aurantiaca）和心叶烟（Nicotiana glutinosa）均不能被啤酒花潜隐类病毒侵染[13]。

HpLVd主要通过无性繁殖材料、农事操作工具进行传播；也可通过种子（8%传毒率）、花粉传播，但传毒率很低；至今尚无昆虫介体传播的报道[4,13,15]。一旦园中啤酒花感染了HpLVd，其传播速度很快，但其侵染率也因啤酒花品种而异[2]。在捷克种植Osvald’s clone 72品种的啤酒花园植株3 a内感染率从零星侵染增至65%[15]；在英国种植cv.Omega品种的啤酒花园植株2 a内受侵染率从个别感病增至75%，而种植cv.Wye Northdown品种的园中啤酒花受侵染却较少[4]。HpLVd在啤酒花体内的含量还与种植地区和季节等有很大关系[2]。在英国春末啤酒花中HpLVd含量较高[16]；在德国，夏季HpLVd含量相对有所下降[6]。

3 基因组结构与序列分析

啤酒花潜隐类病毒的基因组为一条环状单链RNA，长 256 nt，具有 5 个功能区，即：左手区（TL）、致病区（P）、中央保守区（C）、可变区（V）和右手末端区（TR），形成稳定的杆状二级结构。通过不对称滚环模式进行复制，基因组不编码蛋白质[13,17]。

目前，已报道啤酒花潜隐类病毒24个分离物核苷酸的全序列，这些序列之间高度同源，同源性达97.3%～100%。Matoussek等[18]研究表明，受 HpLVd侵染的啤酒花在正常栽培条件下生长，啤酒花潜隐类病毒基因序列不易发生变异，但环境改变可加剧啤酒花潜隐类病毒核苷酸变异，将受HpLVd侵染的啤酒花植株进行热处理，虽然导致了类病毒浓度降低，却增加了很强的序列变异。

4 检测方法

由于啤酒花潜隐类病毒不编码任何蛋白，因此不能利用免疫学（血清学），如酶联免疫吸附（ELISA）的方法来检测；又因HpLVd至今尚无指示植物，故不能通过生物学方法来检测。迄今为止，国内外检测啤酒花潜隐类病毒的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳法[9,13]、核酸杂交法[9,15]和基于RT-PCR的分子生物学检测方法[2,9,12,15,19]。

4.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳法

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是一种基于类病毒RNA分子的特殊环状结构进行检测的方法。该方法检测啤酒花潜隐类病毒常用的有两种，即：二维电泳和往返双向电泳[20-21]。

4.1.1 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳法 二维电泳（2-Dimensional-PAGE）一次只能对一个样品进行检测[20]。Hataya T等利用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳对啤酒花品种VF-cv.Kirin II进行试验，结果显示检测到类病毒条带[9]。

4.1.2 往返双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法 往返双向电泳（Return-PAGE）方法一次可对多个样品进行检测[21]。Holger P等对8个不同品种的啤酒花样品和2个接种HpSVd的西红柿样品进行往返双向聚丙烯酰胺凝胶电泳试验发现，其中有2个品种的啤酒花样品未检测到类病毒条带，另外6个品种的啤酒花样品均检测到不同于HpSVd的环状RNA条带[13]。

二维电泳与往返双向电泳能检测出一种病原物是否为类病毒，且该方法是唯一一种不需要知道类病毒核酸序列就可以进行检测的方法。

4.2 核酸杂交法

核酸杂交方法（Molecular hybridization）是一种分子生物学的标准技术，用于检测DNA或RNA分子的特定序列（靶序列）[22]。啤酒花潜隐类病毒的核酸杂交法有：斑点杂交（Dot blot hybridization）、Northern印迹杂交（Northern blot hybridization）等方法。

4.2.1 斑点杂交法 目前cRNA探针和cDNA探针及合成的寡核甘酸探针已被应用于类病毒的检测[22]。Hataya T等应用HpLVd cDNA探针对日本采集的啤酒花样品进行斑点杂交试验发现，日本啤酒花已受到HpLVd的侵染[9]。Matousek J[23]通过斑点杂交试验检测接种热突变HpLVd的西红柿不同组织中啤酒花潜隐类病毒的含量，结果显示，顶部叶片中HpLVd含量最高。Liu S等[12]应用生物素标记的HpLVd cDNA探针对新疆采集的啤酒花样品进行了斑点杂交检测，发现各个采集地的啤酒花均受到了HpLVd的侵染。斑点杂交方法检测啤酒花潜隐类病毒具有准确、特异性好、灵敏度高的特点，适合于大批量样品检测。

4.2.2 Northern印迹杂交 Northern印迹杂交是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。Holger P等[13]应用Northern印迹杂交技术对啤酒花样品进行试验发现，在55℃条件下放射性HpLVd cRNA探针能与样品中的啤酒花潜隐类病毒核酸成功杂交，而75℃条件下杂交却失败，而放射性HpSVd cRNA探针在55℃和75℃时均能成功杂交。捷克学者Jaroslav M等[24]利用Northern印迹杂交技术对啤酒花花粉进行了HpLVd的成功检测。

核酸杂交灵敏度较高，忠实性强，一次可对大量样品进行检测，但需要有特异性探针。非放射性探针的使用克服了放射性探针存在的如半衰期、安全性、放射性废弃物处理和操作不便等固有的缺陷。用灵敏的荧光底物代替显色底物，尼龙膜代替硝酸纤维素膜，可以提高非放射性检测的灵敏度。使用cRNA探针的信号/背景比cDNA探针要好，说明cRNA探针有较高的灵敏度[25-27]。

4.3 基于RT-PCR的分子生物学检测法

目前，检测与鉴定啤酒花潜隐类病毒基于RTPCR的分子生物学技术主要包括逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）、二重 RT-PCR（multiplex RT-PCR）和实时荧光RT-PCR技术。

4.3.1 逆转录-聚合酶链式反应 逆转录-聚合酶链式反应已广泛用于啤酒花类病毒的检测。国外，Hataya T等应用RT-PCR法和斑点杂交法同时对日本采集的啤酒花样品进行检测，试验结果显示，RT-PCR方法比斑点杂交方法更加灵敏[9]。Matousek等[15]设计了一对特异性引物，研究建立了啤酒花潜隐类病毒的RT-PCR检测方法，并应用该方法对啤酒花种子及杂交苗等进行了成功检测。我国Liu等[12]对新疆7个不同地区采集的16份啤酒花样品进行了HpLVd的成功检测。该方法检测灵敏度高，专一性强。

4.3.2 二重RT-PCR 二重RT-PCR基本原理与常规RT-PCR相同，区别是在同一个反应体系中加入两对引物，同时在同一反应体系中扩增出一条以上的目的DNA片段[28]。Eastwell K C等[2]应用二重RT-PCR方法对美国华盛顿采集的啤酒花样品进行了HpLVd和HpSVd的同时检测，扩增到大小为256 bp和300 bp的两条目的条带。此方法相对于单重RT-PCR而言，更加经济、快速，但对引物的设计要求严格。

4.3.3 实时荧光RT-PCR检测方法 利用TaqMan探针进行实时荧光RT-PCR反应是在常规RTPCR反应体系中添加1条TaqMan探针，从而使荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步[29－30]。郭立新等[19]根据HpLVd的保守基因序列，设计了引物和TaqMan-MGB探针，并利用该引物和探针对新疆采集的啤酒花样品进行了啤酒花潜隐类病毒的成功检测。

迄今为止啤酒花潜隐类病毒的检测方法已从聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法过渡到核酸杂交方法，再进一步发展为RT-PCR等方法。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法费时、费力、灵敏度较低，且不能明确知道是哪种类病毒。核酸杂交法的前提是要制备探针，较为复杂，且检测步骤繁琐。RT-PCR及二重RT-PCR技术虽然简单易行，但需进行PCR后处理，易发生交叉污染，造成假阳性现象。实时荧光检测方法利用荧光探针实时监测目的基因的扩增，实现RT-PCR扩增与探针检测同时进行，整个检测过程完全闭管，不需PCR后处理，是检测HpLVd最灵敏、准确与快速的方法。

5 防治与控制

由于啤酒花主要通过根插或根（状）茎进行无性繁殖[2]，且HpLVd侵染植株不表现明显症状，故感染了啤酒花潜隐类病毒的母本植株仅凭肉眼观察症状、未经分析检测作为繁殖材料，造成了该类病毒在世界各地广泛传播[13]。目前一些学者已进行了脱毒研究，并发现分生组织培养[9]、温热疗法[31]及冷处理[16]能有效降低啤酒花中HpLVd含量。Hataya T等[9]对受HpLVd侵染的啤酒花进行分生组织培养，获得2个无类病毒的无性繁殖材料。Matousek J等研究表明，热处理能降低啤酒花中HpLVd含量，将啤酒花保持35℃培养2周，其体内HpLVd含量下降70%～90%[18,31]。ADAMS A N等[32]将侵染HpLVd的啤酒花在黑暗条件下保持2~4℃培养几个月后再进行分生组织培养，可获得无HpLVd的植株。啤酒花潜隐类病毒可通过农事操作工具进行传播，在农事操作时应使用化学药剂对工具、机械进行消毒，尽可能防止交叉感染[15]。

6 结束语

笔者较为系统地综述了啤酒花潜隐类病毒的分布与危害、生物学特性、基因组结构与序列分析、检测方法及预防与控制等方面的研究进展。明确了HpLVd是一种流行范围广、难以防治、对啤酒花生产造成一定经济损失的潜隐类病毒。清楚了解了其基因组及核苷酸序列之间的同源性。同时，本文还分析了当前检测HpLVd的聚丙烯酰胺凝胶电泳法、核酸杂交法、逆转录-聚合酶链式反应、二重RT-PCR和实时荧光RT-PCR技术等各种检测方法的优缺点，并认为实时荧光RT-PCR技术效果最好。最后，概述了防治与控制啤酒花潜隐类病毒的关键是对母本植株进行严格检疫，使用无毒繁殖材料。农事操作时使用化学药剂对工具、机械进行消毒，尽可能防止交叉感染。

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