泛素化在人表皮生长因子受体降解中的研究进展

李 焘综述，刘朝奇，王雄伟审校

（三峡大学:1.神经病学研究所；2.分子生物研究所，湖北 宜昌 443003）

人类表皮生长因子受体（EGFR）是原癌基因c－erBb－1的表达产物，其编码的蛋白质属Ⅰ型跨膜酪氨酸激酶生长因子受体，由3部分组成:胞外区、跨膜区和膜内区，包括EGFR、C－erbB－2、C－erbB－3、C－erbB－44个成员，EGFR 与配体结合而激活后，胞内区的酪氨酸残基自磷酸化转为活性形式，诱发下游信号传导途径（如 PLC－γ、Ras、PI3K、JAK2），引起级联反应，促进肿瘤的发生、增殖、转移、放化疗抵抗。泛素化介导的EGFR降解是下调其活化的一个常见机制［1］。本文对泛素化在EGFR降解中的研究进展综述如下。

1 泛素－蛋白酶系统（UPS）

UPS是真核生物中必不可少的结构，它可以控制包括蛋白激酶在内的多种蛋白。泛素是小分子多肽，可以通过ATP依赖途径激活，泛素与基质蛋白的结合需要3个酶的参与:Ub活化酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）。E1主要活化Ub，E2与活化的Ub作用后通过E3连接酶与酶作用物结合，进而促使了酶作用物的泛素化，E3连接酶HECT结构域和RING结构域2个独特的类型。具有HECT的E3连接酶与Ub结合形成硫酯键，进而将E3连接酶直接转移到酶作用物，具有RING结构域的E3连接酶不与Ub结合形成硫酯键，它主要是作为适配器来促使E2结合酶与酶作用物结合，进而促使泛素与酶作用物的结合［2］。c－Cbl是一个新发现的E3泛素连接酶，可以通过指环结构域与E2泛素结合酶结合，导致底物泛素化和降解。

表皮细胞生长因子（EGF）与受体结合，磷酸化的c－Cbl补充到细胞膜表面，并通过TKB与活化的EGFR的Y1045结合，随后共定位于核内体和多泡小体中，E2泛素结合酶Ubc4／5与细胞膜上的c－Cbl协同作用，随后进入Hrs阳性核内体，提示EGFR在内在化后被泛素化［3］。Frey等［4］发现，EGFR的泛素化需要EGFR激酶的活化和Y1045位点的磷酸化，此外，活化的P38也参与了此过程。在人胶质母细胞瘤结构性激活的EGFRvⅢ中，Y1045的突变抑制了Cbl－b介导的EGFRvⅢ的泛素化和信号下调，因此加强了EGFRvⅢ对细胞的转换能力［5］。

Huang等［6］通过质谱分析法发现，EGF介导了EGFR激酶域中亮氨酸富集序列的泛素化，亮氨酸残基在激酶域的突变可以阻止EGFR的泛素化和降解，Y1045的突变可以很大程度的减少但并不能消除这些残基的泛素化，可能与E3连接酶或者非Y1045依赖性的c－Cbl的补充相关。Grb2可以与磷酸化的Y1068或者活化的EGFR的Y1068直接结合，进而通过SH3域与Cbl结合，补充Cbl到EGFR。Shc是具有Grb2的复合体，可以与EGFR中磷酸化的Y1148和Y1173相结合，Cbl也可能直接通过与Shc补充到EGFR［7］。

磷酸化的EGFR能够被下游通路中的PKC所抑制，PKC介导的T654位点的磷酸化抑制了EGFR的磷酸化、泛素化及降解，使内在化的EGFR循环回到细胞膜［8］。RALT与EGFR的结合可以抑制EGFR活性的下调，而跨膜蛋白LRIG1与EGFR和c－Cbl结合、ACK1与活化的EGFR的相互作用均可以促进 EGFR 活性的下调［7，9］。

EGF还可以激活EGFR的类泛素化修饰，进而加强随后的泛素化和挑选EGFR进行降解，EGFR的类泛素化修饰与泛素化相互协调，加速了受体降解前的挑选［10］。此外，网格蛋白依赖性和脂筏依赖性内吞作用也参与了EGFR分子的泛素化，EGFR可以通过网格蛋白依赖性内吞作用内在化，然后循环回到细胞表面，与此相反，EGFR通过脂筏依赖性内吞作用内在化后优先进行降解［11］。

2 Cbl对EGFR的调节

Cbl家族中其他两个成员Cbl－b和Cbl－3也参与促进EGFR降解，活化的EGFR不仅可以降低Cbl－b及其酶作用物Shc和Grb2的降解，促进了Shc和Grb2相互作用，还增强了Shc和Grb2在细胞膜的补充。目前研究认为，有3个蛋白质（Nedd4、Itch及HECTE3连接酶的 WW域）参与了早期的内吞作用的调节，它们可以与Cbl－b结合并促进其在蛋白酶体中的降解，Nedd4可以与Cbl－b结合并促进其在蛋白酶体中的降解，翻转Cbl－b对EGFR的泛素化和降解作用，并可以激活c－Src，因此提供了另一个对Cbl酶作用物的直接调节的机制［12］。

v－Cbl和70Z－Cbl是c－Cbl的两个指环结构缺陷的致癌突变体。v－Cbl是具有355个氨基酸的蛋白质，70Z－Cbl是缺乏17个内在氨基酸的突变体，并且这17个内在氨基酸与指环结构存在部分重叠，指环域的突变可以导致E3连接酶的活性消失，但仍然不足以引起细胞的恶性转化，与此相反，与SH2和指环结构连接的高度保守的α螺旋结构的突变促使了Cbl蛋白的致癌作用，这可能是通过破坏Cbl和Ubc的TKB域导致EGFR的泛素化和下调功能的缺失。Baldys等［13］发现，c－Cbl促进双调蛋白介导的EGFR循环回细胞膜，并介导了ERK1／2MAPK的磷酸化激活。此外，c－Cbl还可以通过上调 MMp2的水平增加胶质瘤细胞的侵袭性［14］。

3 泛素化与早期内吞作用

SH2结构域和指环结构在EGFR泛素化中扮演重要角色，c－Cbl具有聚脯精氨酸结构的C端与CIN85（85×103长度的c－Cbl相互作用蛋白）N端的SH3域结合，可以补充CIN85－内吞蛋白复合体到活化的EGFR，内吞蛋白通过SH3域与CIN85结合，在早期的内吞作用中调节细胞膜的内陷，c－Cbl与Sprouty2的相互作用可以对EGFR进行调整，Sprouty2与CIN85和c－Cbl构成了一个三位复合体，阻止CIN85介导的c－Cbl的聚集及CIN85对EGFR泛素化的阻断。Feng等［15］研究发现，Sprouty2通过与c－Cbl共同作用增加EGFR的整体水平及磷酸化水平，进而降低大肠癌细胞对EGFR靶点药物gefitinib的敏感性。同样，β－Pix的SH3域与Cdc42形成复合体，然后和CIN85一起与c－Cbl的脯氨酸精氨酸富集区结合，进而抑制c－Cbl对EGFR负性调节功能，反之，c－Cbl促进β－Pix的泛素化及降解［16－17］，此外，与CIN85相互作用的凋亡关联蛋白ALG－2相关蛋白X（Alix）和具有UBA和SH3结构的T细胞Ub配体（TULA）通过与CIN85或者c－Cbl结合抑制EGFR泛素化［18］。Wakasaki等［19］发现，CIN85可以促进 TGF－α介导的RAS及下游通路的激活，进而促进HNSCC肿瘤细胞的增殖，而不影响EGFR的磷酸化水平。

Hrs和信号转换衔接分子（STAM）是EGFR内吞作用的调节因子，具有UIM域，Hrs与STAM共同作用并共同定位于早期核内体膜表面。Hrs－STAM复合体可以通过识别活化的EGFR的Ub挑选受体，并促使挑选的受体从早期的核内体进入多泡小体中（MVB）。EGF激活作用上调后，Hrs的Y329和Y334位点以Cbl E3连接酶依赖性的方式出现磷酸化，促进Hrs和EGFR的降解，Hrs或者STAM的删除或者缺陷的哺乳动物细胞抑制EGFR的降解［18］。去泛素化酶USP8与Hrs的作用相反，可以通过与STAM结合而减慢去泛素化过程，使得EGFR的降解减少［20］，而机体维持Hrs与USP8平衡的机制尚不清楚，可能与肿瘤细胞所处的微环境有关。

4 泛素化与晚期内吞作用

目前仍不完全清楚机体是通过何种机制精确调节EGFR的降解而不是回到细胞膜，研究认为泛素与转运必需内吞体分选复合物（ESCRT）的相互作用在MVB的挑选过程中发挥重要作用。

在酵母菌中，ESCRT－Ⅰ基因由Vps23、Vps 28及Vps37组成，Vps23是哺乳动物易感基因Tsg101的同源体，ESCRT－1编码产生一段350×103长的保守蛋白复合体，可以短暂地从胞浆补充到核内体膜上［1］，ESCRT－Ⅱ是由 Vps22、Vps25以及Vps36组成的复合体，编码产生155×103的蛋白，ESCRT－Ⅲ是由2个功能性子复体构成:一个由Snf7／CHMP4a和Vps20／CHMP6构成的近膜子复体，另一个由Vps2／CHMP2a和Vps24／／CHMP3构成的外围关联子复体，ESCRT－Ⅲ易位到核内体的过程依赖于ESCRT－Ⅱ的参与［21］。

泛素化的EGFR被挑选进入MVB首先由HRS（Hrs蛋白调控酪氨酸激酶ESCRT－0）触发，HRS可以通过串联泛素结合模体（UIM）与泛素化的EGFR结合，进而通过FYVE域与3磷酸磷脂酰肌醇结合后定位到核内体膜。随后HRS通过PSAP序列域召集ESCRT－1到核内体膜上的着锚点，ESCRT－Ⅰ可以通过其组件中的TSG101中的UEV域识别泛素化的EGFR，ESCRT－Ⅱ可以通过其Vps36的Np14锌指结构（NZF）识别泛素化的EGFR，EGFR随后通过ESCRT－Ⅲ复合体聚集，泛素则通过去泛素化酶DOA4移除，聚集的EGFR被挑选进入MVB的囊泡中，ESCRT复合体通过ATP酶相关活性蛋白Vps4分离出来［22－23］。包括HIV在内的多种病毒具有泛素化的GAG蛋白，可以与TSG101结合，进而补充ESCRT到细胞膜表面，以及在MVB中通过同样的方式引起病毒颗粒的出胞作用［24－25］。此外，AMSH、AMSH 结构样蛋白及其他的泛素分解酶（DUB）比如泛素特异蛋白酶8（DOA4的直系同源体），能够在泛素化的EGFR进入MVB之前将Ub残基分离，从而促使Ub循环回到细胞质［18，26］。目前仍不清楚DUB在内吞作用中不同阶段协同EGFR去泛素化的机制。

5 ErbB2、ErbB3、ErbB4与泛素化的关系

ErbB2的高表达与肿瘤的预后不良呈正相关。EGF、神经调节蛋白和ErbB2特异性抑制性抗体都可以介导ErbB2的泛素化和降解，这些抗体与ErbB2结合后补充c－Cbl到ErbB2的Y1112位。Y1112的突变可以阻碍抗体介导的ErbB2的降解［27］。c－Cbl参与配体介导的EGFR家族蛋白的降解，这个过程需要EGFR蛋白的C端激酶活化和酪氨酸磷酸化，在配体依赖性机制中，只有受体所在部位的细胞膜被作为靶点，而ErbB2烷基化主要作用在位于EGFR核酸连接部位的半胱氨酸残基［18］。ErbB2和Hsp90抑制剂可以调节UPS介导的早期的和成熟的ErbB2的降解，E3连接酶和CHIP也有可能参与调节这个过程［28］。此外，具有指环结构域的Nrdp1可以激活ErbB3的泛素化和降解，Itch的过度表达可以通过 WW域与ErbB4受体结合，进而促进其聚泛素化和降解，但是不能与EGFR、ErbB－2及 ErbB－3作用［18］。

6 展 望

EGFR的过度表达与肿瘤的发生、侵袭性、耐药性及放疗耐受相关，泛素化介导的EGFR降解是下调其活化的一个常见机制，泛素介导EGFR在细胞内的降解机制尚不完全清楚，相信这些问题的解决将有利于理解泛素化与EGFR相关性肿瘤发生发展中的关系，进而解释泛素化在肿瘤研究中的前景。

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