反应曲线在速率法检测AST底物耗尽现象中的应用

任峥 邹翠美 夏春燕

酶活性检测是临床生化常规一个重要组成部分，全自动生化分析仪由于其高精密度和光栅的应用，为用速率法准确检测各种酶的活性提供了很好的保证。当标本中酶含量过高，此时就容易出现在检测过程中酶的底物短时间内消耗殆尽，即从开始读点之前至反应终点的吸光度反应曲线的一段或整段为一平坦曲线，使得反应吸光度变化近乎为零，其斜率不符合实际情况，所得反应结果也与真实值不符，这种现象称为底物耗尽［1］。此种情况下，检验者若只从检验结果分析往往会发出错误的报告，从而影响临床诊断和治疗。本文通过对16例AST高值标本进行原倍和稀释5倍、10倍进行测定，再通过对反应曲线的观察分析，发现和解决底物耗尽现象问题。

资料与方法

1.检测对象:16例AST高值标本。

2.检测方法:将16例AST高值标本分为对照组和问题组，分别检测其原倍及去离子水稀释5倍、10倍标本的AST值，结果乘以稀释倍数。所有标本均测三次，取平均值。

3.统计学方法:将对照组及问题组各高值标本5倍稀释结果与未稀释结果，10倍稀释结果分别与未稀释结果和5倍稀释结果进行多样本比较的秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

对照组及问题组原倍和去离子水稀释5倍及10倍检测结果见表1，对照组1－8号标本原倍分别与5倍、10倍稀释结果比较，5倍稀释与10倍稀释结果比较，差异均无统计学意义(P＞0.05);问题组1－8号标本原倍分别与5倍、10倍稀释结果进行比较，5倍稀释与10倍稀释结果比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)，问题组样本两两比较结果见表2。

表1 AST高值标本原倍及稀释检测结果(kruskal－wallis H检验)(单位U/L)

表2 问题组样本两两比较秩和检验(Nemenyi检验)结果

讨 论

在酶促反应过程中，不是任何时期的反应速率都和酶浓度成正比。当酶促反应刚一开始，底物处于过量状态，酶与底物开始结合，生成复合物(ES)，底物浓度开始下降，此时产物尚未形成。当复合物(ES)分解生成产物(P)，酶促反应速度急聚上升，经过很短的作用时间后，产物的生成量或底物的减少量与反应时间成线性关系，反应速度保持恒定不变，这一时期称为零级反应期。由于只有在零级反应期，单位时间内吸光度的变化值才与酶的活性成正比，当样本中AST的活性超过检测线性范围时，底物在短时间内被耗尽，零级反应期很短，速率法检测所设定的吸光度读点完全不在零级反应期，以致零级反应期内检测不到吸光度的变化而出现低值甚至负值结果。

通过观察1－16号标本反应曲线发现，对照组1－8号标本不存在底物耗尽现象，其反应曲线在加入试剂2后，所有反应曲线为一下降直线，说明这一期间反应速度保持恒定，吸光度变化值与酶浓度成正比，即△A/点(吸光度变化率)是一定值。问题组1－8号标本存在底物耗尽现象，其反应曲线在加入试剂2后，其下降曲线都会出现长短不一的一段平坦曲线，这是由于在反应过程中酶底物耗尽使得多个反应点吸光度趋于一致，曲线产生一段平台期，△A/点≈0，甚至可能是一负值，则计算出的结果不是真实值。

综上所述，底物耗尽现象在速率法检测酶活性时都有可能存在，每天通过观察其反应曲线，可以及时发现检测中是否存在此现象，如有底物耗尽现象，可通过稀释样本重新检测得以解决，这样可以避免因错误结果而延误对患者的诊断治疗。

1 黄志伟.AST动力学法测定时底物耗尽现象浅析［J］.现代医学仪器与应用，2005，17(2):30 －32.