猪胆汁中三种主要胆汁酸的提取分离

邓启华，姚 颖，刘 婷，敬玲玲，李子成

(1.四川化工职业技术学院 制药与环境工程系，四川 泸州 646005;2.四川大学 化工学院，四川 成都 610065)

猪胆汁中三种主要胆汁酸的提取分离

邓启华1，姚 颖2，刘 婷2，敬玲玲2，李子成2

(1.四川化工职业技术学院 制药与环境工程系，四川 泸州 646005;2.四川大学 化工学院，四川 成都 610065)

目的 从提取胆红素下脚料中同时提取三种胆汁酸。方法 混合猪胆汁酸粗品在硫酸催化下形成甲酯，利用猪去氧胆酸甲酯与苯形成的加合物不溶于苯的性质将其分离出来;用乙酸酐将剩余胆汁酸甲酯中的所有羟基转化为乙酸酯，利用猪胆酸甲酯三乙酸酯在正己烷中溶解度低的性质，使其分离，最后用无水乙醇结晶分离出鹅去氧胆酸甲酯二乙酸酯。所得各种猪胆汁酸酯经乙醇-NaOH溶液水解得到纯猪去氧胆酸、猪胆酸和鹅去氧胆酸，并对产物结构进行了表征，纯度经HPLC测定均大于98%。结果 通过一次工艺流程分离出三种胆酸，含量均大于98%。结论 该提取工艺提高了原料的利用率，适合工业化生产。

猪胆汁酸;猪去氧胆酸;鹅去氧胆酸;猪胆酸;提取;分离

胆汁酸是胆汁的主要成分，约占胆汁总量的50% ～70%，主要由猪去氧胆酸、猪胆酸、鹅去氧胆酸、3α-羟基-6-氧-5α-胆烷酸以及胆石酸等组成，其中猪去氧胆酸约占40%，鹅去氧胆酸约占25%。目前，猪胆汁的利用主要是提取猪去氧胆酸或鹅去氧胆酸，但很少有工艺能一次性将猪胆汁中的几个成分分离［1-3］。在提取猪去氧胆酸时主要采用大量乙酸乙酯进行提取和纯化，所得产品纯度低。也有对乙酸乙酯提取物采用丙酮重结晶法，甲醇(或乙醇)-水重结晶法等，但需要使用大量有机溶剂，而且生产周期长，不能大规模生产。鹅去氧胆酸的提取主要采用钡盐沉淀法［4］，结晶提取法［5］、离子交换树脂法，这些方法提取收率低，纯度仅90%左右。

本研究参考文献［6］，先将猪总胆汁酸甲酯化，得到混合胆酸甲酯，加入苯或甲苯以加合物的形式分离出猪去氧胆酸甲酯;剩下的成分用乙酸酐将胆酸甲酯中含有的羟基全部乙酰化，再根据它们在正己烷或石油醚中的溶解性差异加以分离，得到猪胆酸甲酯三乙酸酯，最后再用乙醇将鹅去氧胆酸甲酯二乙酸酯结晶析出。这样不仅得到猪去氧胆酸甲酯，还有猪胆酸甲酯三乙酸酯及鹅去氧胆酸甲酯二乙酸酯，再分别进行水解即得到猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸和猪胆酸。该法不仅高效地得到了高纯度的猪去氧胆酸，还得到了高纯度的猪胆酸和鹅去氧胆酸，提高了猪胆汁的综合利用效率。

1 材料

混合猪胆汁酸为四川弘茂制药有限公司皂化后粗品。所用试剂和溶剂均为分析纯。

Yanaco显微熔点仪(温度未经校正);AllTech hplc 426，Alltech ELSD2000蒸发光散射检测器;Varian INOVA 400高分辨率核磁共振波谱仪(溶剂DMSO-d6，TMS作内标);A12630 APIV/6W 自动旋光仪;Finnigan LCQDECA型质谱仪。

2 方法

2.1 混合胆汁酸的甲酯化和猪去氧胆酸的提取

在1 L烧瓶中加入混合胆汁酸粗品100 g，甲醇500 mL，搅拌溶解后，缓慢滴加硫酸7 mL，并于室温下搅拌24 h，薄层色谱(TLC)监测反应完毕。以无水NaHCO3固体调pH至中性，过滤掉无机盐，滤饼用甲醇洗涤，合并滤液及洗液，减压回收甲醇，得棕褐色黏稠状物，加水100 mL溶解其中的无机盐，再以乙醚提取有机物，合并有机相，分别以饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，减压除去乙醚，得棕色黏稠物105 g。

向烧瓶中加入苯300 mL，于80℃加热溶解后自然冷却至室温，析出固体，过滤，滤饼以苯洗涤2～3次，得到类白色固体58 g，再用苯重结晶，干燥后得白色固体52 g，经TLC检测为单一斑点，展开剂为乙酸乙酯-石油醚(3∶1)，Rf值为 0.49;mp(熔点)87～88℃，即猪去氧胆酸甲酯-苯加合物，收率41%。

在100 mL烧瓶中加入猪去氧胆酸甲酯-苯加合物50 g，NaOH 5 g，乙醇 100 mL 和水 10 mL，于 80℃搅拌回流反应5 h，TLC监测反应完毕后，减压回收溶剂至干，得淡黄色固体，加水150 mL，搅拌下用10%盐酸溶液调pH至1～2，析出固体，继续在常温下搅拌0.5 h，过滤，滤饼用水洗涤至中性，于50℃真空干燥6～8 h，得到淡黄色固体37.2 g，纯度为95.6%。以乙酸乙酯重结晶，得猪去氧胆酸35.4 g，mp 201 ～202 ℃，纯度99.1%，总收率36.8%，气相色谱(GC)分析未检测出苯。1HNMR:δ11.96(s，1H，

)，4.42(d，J=4.4Hz，1H，3-OH)，4.21(d，J=4.0Hz，6-OH)，3.82(m，1H，6-CH)，3.29(m，1H，3-CH)，2.25(m，1H，23-CH)，2.08(m，1H，23-CH)，1.92(m，1H，12-CH)，1.86 ～1.72(m，2H，2-CH，4-CH)，1.72 ～1.76(m，2H，1-CH，22-CH)，1.22～1.58(m，9H)，0.87 ～1.22(m，10H)，0.86(d，J=6.4Hz，3H，21-CH3)，0.84(s，3H，19-CH3)，0.60(s，3H，18-CH3).=+8.2°(c=1，甲醇);MS:393.311 3(M+H+，理论值 393.299 9)。

2.2 猪胆酸的提取和纯化

将2.1项下的滤液、洗液以及重结晶母液合并，减压回收苯至尽，得到棕色黏稠状物65 g。加入乙酸酐150 mL，乙酸钠15 g，于110℃回流5 h，TLC监测反应完成后，减压蒸除约2/3体积的乙酸酐，待降至室温后加水50 mL以溶解其中的无机盐，用乙醚分次提取有机物，合并有机相，先用1%NaOH溶液洗涤有机相至接近中性，再用饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，回收乙醚，得棕黑色黏稠状物76 g。向烧瓶中加入正己烷250 mL，体系升温至65℃搅拌使其完全溶解后停止加热，自然降至室温，在室温下搅拌2 h，过滤，滤饼用正己烷洗涤3次，干燥后得到棕色粉末17 g，依次以甲醇及苯-石油醚重结晶，得白色粉末8.2 g，mp 184～186℃(文献值181～183 ℃［1］)，为猪胆酸甲酯三醋酸酯。

取250 mL圆底烧瓶，依次加入猪胆酸甲酯三醋酸酯8 g(14.6 mmol)，NaOH 5 g(125 mmol)，乙醇50 mL，水5 mL，于80℃回流反应6 h，TLC监测反应完毕后，减压回收溶剂，得灰白色固体，加水10 mL，剧烈搅拌下用10%盐酸调节而至pH 1～2，过滤，滤饼用5%盐酸洗涤一次，再用水洗涤至中性，干燥后得到浅黄色固体5.5 g。用乙酸乙酯重结晶，干燥至恒重，得白色粉末5.1 g，TLC检测为单一斑点，展开剂为乙酸乙酯-石油醚-乙酸(5∶5∶1)，Rf值为0.28;mp 185～186 ℃(文献值183～184 ℃［1］］，即为猪胆酸，总收率为 5.1%。1HNMR:δ11.96(s，1H，COOH)，4.33(d，J=4.4 Hz，1H，3-OH)，4.20(d，J=5.6 Hz，1H，6-OH)，3.90(s，1H，7-OH)，3.57(brs，2H，6-CH，7-CH)，3.11(brs，1H，3-CH)，2.08～2.33(m，2H，23-CH3)，1.80 ～ 1.92(m，1H，12-CH)，1.56 ～1.72(m，7H)，0.96 ～ 1.50(m，14H)，0.88(d，J=6.4 Hz，21-CH3)，0.83(s，3H，19-CH3)，0.60(s，3H，18-CH3)。MS:409.298 5(M+H+，理论值为 409.294 9)，431.281 7(M+Na+，理论值)。［α］D(c=1.7，甲醇)，Combined Chemical Dictionary(CCD)中=+5.5°(c=1.7，甲醇)。

2.3 鹅去氧胆酸的提取与纯化

将提取完猪胆酸甲酯三醋酸酯的母液与重结晶母液合并，回收溶剂，得到棕褐色黏稠状物56 g，此时其主要成分为鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯。加入乙醇100 mL，升温至65℃待黏稠物全部溶解后停止加热，体系自然降至室温后于冰箱中静置72 h，析出黄色固体，过滤，滤饼用冰冷甲醇洗涤，干燥后得淡黄色粉末23 g。用甲醇重结晶，得白色粉末18.6 g，TLC检测为单一斑点，展开剂为乙酸乙酯-石油醚(3∶1)，Rf=0.56;mp 115 ～116 ℃(文献值 112 ～113℃［7］)，为鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯。

取250 mL圆底烧瓶，依次加入鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯 18 g(36.7 mmol)，NaOH 5 g(125 mmol)，乙醇100 mL，水10 mL，于80℃回流5 h，TLC监测反应完毕后，减压回收溶剂，得灰白色固体，加水20 mL，剧烈搅拌下用10%盐酸溶液调pH至1～2，析出固体，继续于常温下搅拌0.5 h，过滤，滤饼依次用5%盐酸和水洗涤，减压干燥后得到白色固体13.1 g。用丙酮－水重结晶，干燥至恒重后得白色粉末12.6 g，TLC检测为单一斑点，展开剂为乙酸乙酯-石油醚-乙酸(5∶5∶1)，Rf=0.41;mp 144 ～146 ℃(文献值143 ～144 ℃［7］)，总收率 15%。=+10.2°(c=1，甲醇)［CCD 中= +11°(乙醇)］。1HNMR:δ11.97(s，1H，24-COOH)，4.33(d，J=4.4Hz，1H，3-OH)，4.13(d，J=3.2Hz，7-OH)，3.62(m，1H，7-CH)，3.18(m，1H，3-CH)，2.23 ～2.18(m，1H，23-CH)，2.12 ～ 2.10(m，1H，23-CH)，1.91(m，1H，12-CH)，1.82 ～ 1.66(m，6H)，1.48 ～1.35(m，6H)，1.27 ～1.14(m，7H)，1.11 ～1.06(m，4H)，0.86(d，J=6.8Hz，3H，21-CH3)，0.84(s，3H，19-CH3)，0.60(s，3H，18-CH3)。

3 结果与讨论

3.1 酸催化剂的种类及用量对甲酯化反应的影响

甲酯化反应中酸催化剂的使用对实验结果影响较大。因此选择对甲苯磺酸、磷酸和硫酸对酯化反应进行了考察，反应条件为常温下搅拌24 h。

发现三种酸均可催化该反应，但硫酸在常温下即可较好的催化该反应，当投料比为1∶0.5时，室温24 h即可完成反应，因此，选用硫酸作为酸催化剂，确定原料与硫酸的投料比为1∶0.5。

3.2 猪胆酸酯的提取溶剂对产物影响

由于用乙酸酐酯化后的产物为棕色黏稠物，不易分离，要选取一个适宜的提取溶剂来提取猪胆酸酯。取同批次的棕色黏稠物各5 g，考察了正戊烷，正己烷以及石油醚的提取效果。结果发现正己烷作为提取溶剂时收率最高，因此本研究选取正己烷作为提取猪胆酸酯的溶剂。

3.3 重结晶溶剂对猪胆酸酯收率的影响

由正己烷提取出的猪胆酸甲酯三醋酸酯干燥后为淡棕色固体，用甲醇重结晶后得到类白色固体，再用溶剂进行二次重结晶，考察了苯、苯-石油醚作为重结晶溶剂对产品收率的影响，发现单独使用苯作为重结晶溶剂时，收率仅为52%，而使用苯-石油醚重结晶时收率达到86.2%，而且得到的产品纯度经高效液相色谱(HPLC)分析，含量大于98%，因此选用苯-石油醚作为此步的重结晶试剂。

3.4 提取溶剂及时间对鹅去氧胆酸酯收率的影响

得到除去溶剂后的棕褐色黏稠物后，取等量的棕色黏稠物各5 g，考察了甲醇和乙醇作为鹅去氧胆酸酯的提取溶剂，以及提取时间对产品的影响，结果发现，乙醇对鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯的提取效率明显高于甲醇，而且随着提取时间的延长，提取效率也在缓慢提高，但在72 h后已经不再有明显变化，故本研究选取乙醇作为鹅去氧胆酸甲酯醋酸酯的提取溶剂，并确定提取时间为72 h。

3.5 重结晶溶剂对鹅去氧胆酸甲酯乙酸酯收率的影响

用甲醇重结晶时溶剂量虽然较大，但有利于搅拌和产物从容器中取出，产品损失量稍大;用乙醇重结晶时，用量少，收率稍高，但产物的搅拌和从容器中取出困难。因此选用甲醇作为鹅去氧胆酸甲酯二醋酸酯的重结晶溶剂。

此外，分离出的三种胆酸的红外光谱均与标准红外光谱一致。

［1］沈季铭，周维善.猪胆汁中胆烷酸的分离和鉴定［J］.医药工业，1988(12):529-531.

［2］苏 红，叶利民，杨轶浠，等.猪去氧胆酸的纯化工艺［J］.华西药学杂志，2006(4):360-362.

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The extraction and purification of three kinds of bile acids from pig bile

DENG Qi-hua1，YAO Ying2，LIU Ting2，JING Ling-ling2，LI Zi-cheng2
(1.Department of Pharmaceutical and Environmental Engineering，Sichuan Chemical Vocation Technology College，Luzhou 646005，China;2.School of Chemical Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China)

Purpose To prepare three bile acids from the mixed pig bile acids.Methods The mixed pig bile acids were first methyl-esterified then methyl hyodeoxycholanate was separated and recrystallized from benzene because of the insolubility of methyl hyodeoxycholanate-benzene complex in benzene，The mother liquor was distilled and then acetic acid anhydride was added to make all the hydroxyl of bile acid methyl esters transforming to acetate ester.Methyl hyocholanate triacetate was separated in hexane，methyl chenodeoxycholanate diacetate was precipitated from ethanol，and purified by recrystallization from methanol.After hydrolyzing of the three kinds of separated bile acid methyl esters，three individual components whose purities were higher than 98%were obtained.Results By this extraction process could be isolated pure hyodeoxycholic acid，hyocholic acid and chenodeoxycholic acid at one time with short steps，simplified method and less solvent.Conclusion The route，which could not only make the best recycle of raw material，but also reduce environmental pollution，is applicable to the industrial production.

hyodeoxycholic acid;hyocholic acid;hyodeoxycholic acid;extraction;purification

TQ464.5

A

1005-1678(2012)04-0405-03

2011-07-02

邓启华，男，副教授，主要从事药物中间体及药物合成;李子成，男，通信作者，副教授，Tel:13678019184，E-mail:sculzc@scu.edu.cn。