海洋无脊椎动物酚氧化酶的研究进展＊

樊廷俊，荆 昭，樊现远

（中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛266003）

海洋无脊椎动物酚氧化酶的研究进展＊

樊廷俊，荆 昭，樊现远

（中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛266003）

海洋无脊椎动物缺乏真正意义上的抗体，没有免疫记忆，只能靠非特异性免疫系统防御和抵抗病原体的感染。酚氧化酶原激活系统是海洋无脊椎动物非特异性免疫系统中至关重要的一员，而酚氧化酶作为该系统末端的一种含铜金属酶，则通过催化黑化反应在海洋无脊椎动物非特异性免疫防御中发挥了关键的作用。本文结合作者已有的研究成果并综合本领域的大量参考文献对酚氧化酶原激活系统和酚氧化酶的免疫学功能、激活机制、生化性质与酶性质以及基因与分子结构等方面的研究进展进行综述。

酚氧化酶；酚氧化酶原激活系统；海洋无脊椎动物

随着海洋无脊椎动物养殖业集约化程度的提高，各种疾病的发生日益频繁，造成了巨大的经济损失，已成为限制海水养殖业发展的主要因素之一［1］。为了避免或减少疾病给海水养殖业造成的不利影响，越来越多的学者开始关注并研究海洋无脊椎动物的免疫系统。

海洋无脊椎动物具有开放式循环系统，体液中没有T细胞及免疫球蛋白，因而不具备脊椎动物复杂的特异性免疫系统。大部分海洋无脊椎动物的体表具有坚硬的钙质或几丁质外壳作为抵御外界入侵的物理屏障。但海洋中存在的大量病原体仍然可以通过一些途径，例如创伤和摄食等，突破这道物理屏障。在漫长的与病原体的斗争中，海洋无脊椎动物发展了一套不同于脊椎动物的，以血细胞和体液因子为基础的非特异性免疫系统来防御和抵抗外界病原体的侵袭［2－3］，其中，酚氧化酶（phenoloxidase，PO）与酚氧化酶原激活系统（prophenoloxidase－activating system，proPOAS）发挥了至关重要的作用［4］，因而受到了国内外学者的广泛关注。本文结合作者已有的研究成果并综合本领域的大量参考文献对PO和proPO－AS的免疫学功能、激活机制、生化性质与酶性质以及基因与分子结构等方面的研究进展进行综述。

1 酚氧化酶与酚氧化酶原激活系统

1.1 酚氧化酶与酚氧化酶原激活系统的功能

酚氧化酶（PO）是一类含铜的氧化酶，广泛存在于动物、植物和微生物体内。1917年，Bloch发现L－3，4－二羟苯丙氨酸（L－DOPA）可作为体外人体皮肤黑色素细胞中黑色素形成的底物，此后，学者们均以该底物作为PO研究的特异性底物。由于研究的物种、方法与标准不同，长期以来，不同文献对于PO的命名也不尽相同，如酪氨酸酶（tyrosinase）、单酚氧化酶（monophenoloxidase）和PO，3个名称却对应于同一个酶学编码（E.C.1.14.18.1），为了消除这种命名的混乱，Sugumaran［5］于1996年根据信号肽和跨膜域序列的分子结构差异将酪氨酸酶专用于哺乳动物、PO专用于无脊椎动物，因为无脊椎动物PO没有信号肽和跨膜域序列。目前，该命名方法已被学术界普遍接受［6］。

在脊椎动物中，PO主要参与皮肤色素和其它多酚化合物的形成［7］；而在无脊椎动物中，PO不仅参与黑色素形成，还参与角质硬化、伤口愈合［8］以及宿主的非特异性免疫防御反应［9－12］；在头足类软体动物中，PO还参与墨汁中黑色素和表皮细胞色素的形成［13］。

大量研究显示，无脊椎动物的PO在正常情况下是以无活性的前体——酚氧化酶原（prophenoloxidase，proPO）的形式存在的［2－3，5－6，9－11］，proPO－AS是一种与脊椎动物的补体系统相类似的酶级联反应系统，正常情况下，该系统以非活化状态存在于无脊椎动物血细胞的颗粒中，当病原体入侵时，该系统将被激活并最终导致黑化反应而将病原体清除。病原体表面特有的结构成分如革兰氏阴性菌中的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、革兰氏阳性菌中的肽聚糖（peptidoglycan）以及真菌中的β－1，3－葡聚糖（β－1，3－glucan）等被称为病原相关分子模式（pathogen－associated molecularpatterns，PAMPs），其可被宿主的模式识别蛋白特异性的结合，模式识别蛋白一旦与这些外来物质结合便可激活酚氧化酶原激活酶原（pro－PPAE）转变为具有活性的酚氧化酶原激活酶（prophenoloxidase－activating enzyme，PPAE），并通过限制性蛋白水解作用使proPO裂解，从而释放一个小肽而转变成有活性的PO。激活后的PO可以将酚类底物氧化成醌，醌经一系列非酶促反应生成最终产物——黑色素（melanin）［9－11，13－14］，这种黑色素对于微生物来说是具有毒性的，同时黑色素形成过程中还伴随有具细胞毒性的半醌、三羟酚和活性氧生成，半醌具有结合亲核物质的特性，能结合到病原体细胞的表面，通过形成黑色素包囊来隔离并杀灭入侵的病原体；而活性氧，如超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢一直被认为是脊椎动物和无脊椎动物免疫防御系统的细胞毒性成分［15－16］，其极强的氧化性能够对病原体进行有效的杀伤。

1.2 酚氧化酶原激活系统的组成

无脊椎动物的proPO－AS包括了模式识别蛋白，酚氧化酶原激活酶和酚氧化酶原抑制剂等多种成分，它们协同作用，共同构成了这个复杂的酶级联反应系统。

1.2.1 模式识别蛋白（pattern－recognition proteins）

模式识别蛋白能够识别并结合病原体特有的病原相关分子模式（PAMPs），如革兰氏阴性菌中的LPS、革兰氏阳性菌中的肽聚糖和真菌中的β－1，3－葡聚糖，并进而激活pro－PPAE转变为具有活性的PPAE，通过限制性蛋白水解作用激活proPO转变成有活性的PO。

目前已知的模式识别蛋白主要有脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide－binding protein，LBP）、肽聚糖结合蛋白（peptidoglycan－binding protein，PGBP）和β－葡聚糖结合蛋白（β－1，3－glucan－binding protein，BGBP）3类。LBP已在马蹄蟹（Limulus polyphemus）等海洋无脊椎动物中被发现［17］，它能与LPS结合并激活pro－PO－AS，从不同物种中得到的LBP的分子量、结构以及生化特性有很大的差异，至今仍未发现其共有结构；PGBP是在家蚕（Bombyx mori）中被首次发现的［18］，后来在斑节对虾（Penaeus monodon）等甲壳动物中也有发现［19－20］，它能与肽聚糖结合并激活proPO－AS以及其它多种免疫反应；BGBP最早也是在家蚕（B.mori）中被发现的［21］，能够结合葡聚糖并激活proPOAS，还可引发血细胞的脱颗粒及调理作用［20］，此后在斑节对虾（P.monodon）［22］、加州对虾（Penaeus californiensis）［23］、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）［24］、南美白对虾（Penaeus vannamei）和红额角对虾（Penaeus stylirostris）中也有发现，其为单体蛋白，分子量约为100kDa，氨基酸组成和N－末端序列比较保守［25］，另外在马蹄蟹（L.polyphemus）中也发现了BGBP，其为双亚基蛋白，大亚基包含葡聚糖酶结构域，小亚基包含丝氨酸蛋白酶结构域［26］，其结构与氨基酸序列对比上述几种甲壳类BGBP具有明显的不同。

1.2.2 酚氧化酶原激活酶（prophenoloxidase－activating enzyme，PPAE） PPAE最早是在淡水鳌虾（Pacifastacus leniusculus）中被发现的［27］，后来在海产的蓝蟹（Callinectes sapidus）等物种中也有发现［28］，该酶是一种丝氨酸蛋白酶，分子量约为36kDa，其C－端有一个典型的丝氨酸蛋白酶结构域，而N－端有一个或多个回形结构域，其功能可能与丝氨酸蛋白酶活性的激活有关，还可能与抗菌肽的功能有关［28－29］。

最近有研究者从斑节对虾（P.monodon）血细胞中得到了2种PPAE（PmPPAE1和PmPPAE2）［30］，它们具有丝氨酸蛋白酶家族典型的回形结构域，与已获得的节肢动物PPAE氨基酸序列的比对结果证明其是一类新的甲壳动物PPAE；转录分析显示PmPPAE2主要在血细胞中表达，通过RNAi方法抑制PmPPAE2导致对虾血淋巴中总PO活性的显著减少（41%），同时更易感染哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）；基因组分析表明PmPPAE1和PmPPAE2是由不同的基因座编码的，PmPPAE1基因由10个外显子和9个内含子组成，PmPPAE2由8个外显子和7个内含子组成；对斑节对虾proPO－AS的4个关键基因（PmPPAE1，PmPPAE2，PmproPO1，PmproPO2）在幼虫发育阶段的表达分析表明：PmPPAE1和PmproPO2在全部的幼虫阶段（无节幼虫、前水蚤幼虫、糠虾状幼虫和仔虾）都有表达，而PmPPAE2和PmproPO1主要在幼虫发育的晚期表达（糠虾状幼虫和仔虾）［30］，表明PmPPAE2在虾中发挥了PPAE的功能，而且很可能介导了Pmpro－PO1的激活。

1.2.3 酚氧化酶原抑制剂（prophenoloxidase inhibitor）

由于proPO－AS所产生的醌和黑色素对宿主自身也具有毒性，因而该系统的活性必须受到严格的调控。目前，对proPO抑制剂的研究成果主要来自于果蝇和淡水螯虾，而海洋无脊椎动物的则较少，已研究的pro－PO抑制剂主要有2类：枯草杆菌蛋白酶抑制剂和α－巨球蛋白。前者为单体，分子量约为23kDa，等电点（pI）约为4.7，具较强的热稳定性（可耐80℃高温）和酸碱耐受性（pH＝1.0～11.5）［31］；后者多为二聚体，每个亚基的分子量约为190kDa，可部分抑制PPAE的活性，与脊椎动物的补体蛋白C3和C4具有较高的序列相似性［32］。这些抑制剂可调控proPO－AS的活性以避免其自发或过度激活，从而保护宿主自身免受其毒害。

2 酚氧化酶的生化性质与酶性质

PO在无脊椎动物中广泛存在，现已从许多物种中分离纯化出PO或proPO，并对其生化性质与酶性质进行了研究。依据来源物种的不同，各种PO的分子大小、等电点等生化性质以及最适反应温度、最适反应pH值、底物亲和力和抑制剂等酶性质也相应的存在一定差异。如日本对虾（Penaeus japonicus）PO对LDOPA底物的最适反应温度和pH值分别为40℃和7.0，当温度高于50℃时迅速失活，该酶对三元酚（焦性没食子酸）和二元酚（儿茶酚、L－DOPA）具有较高的底物亲和力，而对单酚（L－酪氨酸）的亲和力很低，且其酶活性能被二硫苏糖醇和半胱氨酸所强烈抑制［33］；而斑节对虾（P.monodon）PO在37℃时具有最高酶活性，且LPS、β－葡聚糖、酵母聚糖和弧菌均能激活其PO活性，而胰蛋白酶、大豆胰蛋白酶抑制剂和苯甲脒等对其活性无影响［34］。

1999年，Gollás－Galvan等［35］对加州对虾（P.californiensis）的研究结果显示，其proPO为分子量114 kDa的单体蛋白，经酶解后可产生一个分子量为107 kDa的PO，二者的等电点均为7.35，PO对L－DOPA底物的最适反应pH值为8.0，其酶活性可被DETC、Cu2＋、叠氮钠、硫脲和EDTA所有效抑制；孙兆峰等［36］对中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）和凡纳滨对虾（L.vannamei）PO活性的研究显示，其最适反应温度分别为50和45℃、最适反应pH值分别为8.5和7.5，且均可为胰蛋白酶、SDS和酵母聚糖所激活；樊廷俊等［14］对中国对虾（Penaeus chinensis）的研究显示，其分子量为87.5kDa的proPO经SDS激活后可产生分子量为77kDa的PO，该PO对L－DOPA的最适反应条件为40℃、pH＝6.0，Km值约为1.99mmol·L－1，且该PO对酪氨酸等单酚也具有较强的底物亲和力，综合各种氧化酶抑制剂、金属螯合剂和金属离子对其活性的影响结果证实其为一种酪氨酸酶型的含铜金属酶；Liu等［37］对日本蟳（Charybdis japonica）血淋巴中proPO和PO的研究结果显示，其分子量分别为69.5和64.5kDa，PO在40℃、pH6.0时具有最高酶活性，其对底物L－DOPA和儿茶酚的Km值分别为3.41和7.97mmol·L－1，综合各种氧化酶抑制剂、金属螯合剂和金属离子的影响结果表明该PO是一种儿茶酚酶型的含铜金属酶；Giménez等［38］对挪威龙虾（Nephrops norvegicus）的壳和内脏中PO的研究结果显示，2种来源的PO活性均随温度的升高而升高，直至60℃，其中提取自壳的PO具有更强的热稳定性，在65℃时仍保持有40%的酶活性，其对儿茶酚的Km值为19.40mmol·L－1，而从内脏中得到的PO对儿茶酚的Km值为5.97mmol·L－1，显示出更强的底物亲和力。

Tetsushi等［39］对鱿鱼（Illex argentinus）PO的研究结果显示，其分子量为140.2kDa，包含2个70.1 kDa的亚基，其最适pH值为8.0；Palumbo［13］研究了乌贼（Sepia officinalis）墨汁中的PO，结果显示其分子量为125kDa，对底物L－DOPA的最适反应pH值为7.5，Km值为10mmol·L－1，而对L－酪氨酸的Km值为3.3mmol·L－1，可见其对L－酪氨酸具有更强的底物亲和力；Fan等［40］从短蛸（Octopus ocellatus）墨囊中也分离纯化出了PO，研究发现其为153.8kDa的异二聚体蛋白，亚基分子量分别为75.6和73.0kDa，其最适反应条件为40℃、pH＝7.0，对底物L－DOPA和儿茶酚的Km值分别为3.1和6.3mmol·L－1，同时综合各种氧化酶抑制剂、金属螯合剂和金属离子对该酶活性的影响表明该PO是一种儿茶酚酶型的含铜金属酶。

孙虎山等［41］对栉孔扇贝（Chamys farreri）血淋巴中PO的研究显示，其最适pH值为6.0，当pH升高或降低时，PO活性均迅速下降，当pH达到7.5时已检测不到PO活性，其最适反应温度为45℃，高于45℃时，该酶的活性迅速下降，而低于45℃时，该酶的活性下降则相对较慢；Cong等［42］对菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）的研究显示，其proPO分子量为84.1 kDa，经激活后可转变为76.9kDa的PO，该PO的最适反应条件为40℃、pH＝7.0，对底物L－DOPA和酪氨酸的Km值分别为2.2和6.0mmol·L－1，同时综合各种氧化酶抑制剂、金属螯合剂和金属离子的影响结果表明该PO是一种酪氨酸酶类型的含铜金属酶。

除上述研究较多的甲壳类、头足类和双壳贝类以外，Frizzo等［43］还研究了海鞘（Botryllus schlosseri）的PO，发现其为由2个亚基经二硫键链接而成的同二聚体蛋白，每个亚基的分子量为80kDa，其对L－DOPA的最适反应pH范围为7.0～7.5，最适反应温度为35℃，Km值为4.62mmol·L－1。

3 酚氧化酶的基因与分子结构

近年来，随着分子生物学技术和其他相关学科的快速发展，对PO的结构及其激活的分子机制等研究均取得了很大进展。目前的研究结果显示，proPO或PO具有2个保守的功能性Cu2＋结合位点，CuA和CuB，2个Cu2＋分别结合了3个组氨酸。在CuB的结构中，有2个组氨酸位于同1个α－螺旋上，而另1个组氨酸则单独位于另1个α－螺旋上，该结构在各物种中高度一致；而CuA的结构则随物种的不同而略有所差异，如节肢动物中的CuA具有与CuB相同的结构；而在软体动物中，CuA的2个组氨酸分别位于2个α－螺旋上，而另1个组氨酸则位于其中1个α－螺旋之后的回环结构中。另外，目前已知的绝大部分无脊椎动物的proPO结构中都没有信号肽［6－7，39，44－46］。

在proPO－AS中，proPO一般是由丝氨酸蛋白酶酶切而形成有活性的PO，其酶切位点因所在物种的不同也不尽相同，如节肢动物proPO的酶切位点在其N－末端，而植物和真菌的proPO则在C－末端。在节肢动物PO的结构中，距离其活性位点约3～4处的Phe49位点非常保守，在其N－末端被切除后，原先占据活性位点的Phe49便被推出，在活性位点处形成一个大的口袋状结构，使底物能够进入。当底物进入活性位点后，其苯环与Cu－O2－Cu平面相垂直，通过羟基与CuA紧密结合，同时苯环的正位与2个氧原子中的一个相结合，催化底物的氧化［45，47］。

Sritunyalucksana等［45］从斑节对虾（P.monodon）的cDNA文库中也克隆到了proPO的序列，结果显示其cDNA全长为3 002bp，其中含有一个2 121bp的读码框。其推测分子量为79kDa，等电点为5.8，存在有2个高度保守的Cu2＋结合位点，无信号肽序列，该proPO激活的裂解位点位于Arg44和Val45之间；氨基酸序列比对结果显示，该proPO与淡水鳌虾的proPO非常相似，而与昆虫的proPO同源性较低。Lai等［46］从凡纳滨对虾（L.vannamei）的血细胞中获得了编码proPO的cDNA，其全长为2 471bp，其中含有1个2 058bp的读码框，其推测分子量为78.1kDa，等电点为6.02，该proPO的结构中包含1个保守的Cu2＋结合位点，1个蛋白质裂解位点和1个保守的C－末端序列，与其他多数无脊椎动物一样，该proPO也没有信号肽序列。另外值得一提的是，在海鞘（Halocynthia roretzi）中克隆到的proPO是具有信号肽和跨膜区的，其与脊椎动物酪氨酸酶的相似性要高于其与其他无脊椎动物proPO的相似性，这表明酪氨酸酶与proPO可能是由同一种Cu结合蛋白进化而来的，它们均属于酪氨酸酶家族［48］。

4 免疫促进剂的应用

各种疾病的频繁发生是当今困扰海洋无脊椎动物养殖业的1个严重问题，但目前对于病毒、细菌、真菌和寄生虫等疾病的预防和治疗仍缺乏有效的措施，传统的抗生素药物也因滥用而失去应有的效力，因此提高海水养殖无脊椎动物的自身免疫力，是目前控制病害的有效途径［49－51］。

免疫促进剂是能够促进或诱发宿主免疫防御反应、增强机体抗病能力的物质［50－51］，主要作用于无脊椎动物的非特异性免疫系统，通过激活机体自身的免疫机能，增强其抗病力。目前，海水养殖动物免疫促进剂主要包括：多糖、寡糖、多肽、病原体抗原、维生素以及化学合成药物等类型［50－53］，其中多糖和病原体抗原是海水养殖业最常用的2类免疫促进剂［52－56］。汪小峰等［51］和樊廷俊等［57］分别利用LPS、β－葡聚糖、灭活鳗弧菌（Vibrio anguillarum）和灭活哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）4种免疫促进剂对中国对虾（P.chinensis）和日本蟳（C.japonica）PO以及血细胞的研究结果显示，经4种免疫促进剂处理后，2种动物的PO产量和总酶活性均有显著增加，但PO的比活性没有显著变化，并证实多糖类免疫促进剂与灭活弧菌类免疫促进剂对非特异性免疫系统的作用机制不同：多糖类免疫促进剂LPS和β－葡聚糖主要作用于大颗粒细胞和小颗粒细胞，提高proPO激活组分的产量，进而提高总PO活性；而灭活弧菌类免疫促进剂主要提高透明细胞和小颗粒细胞的吞噬活性，进而增强机体的免疫力。

Sung等［58－59］的研究表明，β－葡聚糖溶液浸泡的斑节对虾（P.monodon）对弧菌（Vibrio vulnificans）的抗性提高，且经热致死弧菌处理后其PO活性显著提高约13倍，也证实多糖和弧菌类免疫促进剂可通过提高PO的活性进而增强对虾的自身免疫力。李光友等［60］发现，浓度低于10μg／mL的LPS对中国对虾（P.chinensis）血细胞吞噬活性有加强作用，而高于该值时反而会表现出一定毒性。李天道等［61］在研究中国对虾（P.chinensis）时发现，小剂量弧菌（V.vulnificans）能诱导对虾PO活性的升高，但当弧菌密度超过水体中弧菌致病的临界值（105CFU／mL）时却对对虾的免疫力造成负面影响。由此可见，免疫诱导的剂量的高低也影响着受试对象的免疫力，适量的诱导有助于提高动物的自身免疫力，而当诱导剂量过高反而会降低其自身免疫力。因此，利用免疫促进剂诱导提高动物自身免疫力时，不仅要确定能产生最大免疫力的有效诱导剂量，还需要结合不同种虾、蟹的个体差异和实际养殖环境确定最适的实施条件。

5 研究展望

尽管越来越多的proPO－AS相关因子被纯化与鉴定出来，但与之相关的具体激活机制及其在免疫过程中的具体作用等仍不清楚，PO的不同存在形式、存在部位以及激活条件等均尚未确定，颗粒细胞脱颗粒的诱导机制、proPO激活过程的受体和信号通路以及感染过程中细胞间的联系等具体细节也均未查清此外，除PO激活过程中产生的醌和黑色素以外，人们对细胞产生的其它杀菌物质还了解甚少，对病原菌抵抗宿主防御系统的策略等也不清楚，这些问题均有待进一步的研究。上述问题的阐明将有助于人们更好的了解无脊椎动物的非特异性免疫系统的作用机制，同时为海水养殖病害的防御与治疗提供理论依据，具有重要的理论与实践意义。

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Research Advances on Phenoloxidase of Marine Invertebrates

FAN Ting－Jun，JING Zhao，FAN Xian－Yuan
（College of Marine Life Sciences，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Marine invertebrates lack the true meaning of the antibodies and immune memory and have to resist pathogen infection with non－specific immune system.Prophenoloxidase－activating system is one of the most important components of the non－specific immune system in marine invertebrates，but0phenoloxidase，as a terminal copper－containing metalloenzyme in this system，plays a key role in the non－specific immune defense of marine invertebrates by catalyzing melanization.In this paper，the research advances on immunological function，activation mechanism，biochemical and enzymatic properties，as well as gene and molecular structure of PO and proPO－AS are reviewed based on our research achievements and a large number of academic literatures in this field.

phenoloxidase；prophenoloxidase－activating system；marine invertebrates

Q55；Q814

A

1672－5174（2012）1－2－093－07

教育部骨干教师资助计划项目（160004）资助

2011－04－19；

2011－05－23

樊廷俊（1964－），男，博士，教授，博士生导师。主要研究方向：动物细胞工程与细胞分化。E－mail：tjfan＠ouc.edu.cn

责任编辑 朱宝象