单环刺螠纤溶酶UFEⅠ药效作用和免疫原性的初步研究＊

刘万顺，成慧中，韩宝芹，毕庆庆，董 文，关 驰

（中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛266003）

单环刺螠纤溶酶UFEⅠ药效作用和免疫原性的初步研究＊

刘万顺，成慧中，韩宝芹，毕庆庆，董 文，关 驰

（中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛266003）

为评价单环刺螠纤溶酶（UFEⅠ）的抗凝血和抗血栓形成作用，并对其免疫原性进行初步研究。文中通过小鼠血液凝固时间实验和大鼠颈动脉血栓形成模型研究UFEⅠ抗凝血和抗血栓作用。用纯UFEⅠ为抗原免疫小鼠，间接ELISA法测定特异性抗体的动态变化及效价。结果UFEⅠ能明显延长小鼠凝血时间，有效抑制大鼠体内的血栓形成，并显著降低大鼠纤维蛋白原含量（FIB），延长活化部分凝血活酶时间（APTT）。免疫原性的研究结果为UFEⅠ末次免疫小鼠后，产生微量特异性抗体，且抗体水平呈现先升后降的动态变化；方阵法确定了ELISA的优化条件，测定UFEⅠ免疫后产生的抗体效价为1：1 280。本文研究显示，单环刺螠纤溶酶UFEⅠ具有显著的抗凝血和抗血栓形成作用，在小鼠体内产生一过性抗体，但对动物机体不造成负面影响。

单环刺螠；纤溶酶；抗凝血作用；抗血栓作用；免疫原性

血栓栓塞性疾病如脑血栓、冠心病、血栓栓塞性脉管炎及深部血栓性静脉炎对人类健康危害极大。链激酶、尿激酶及组织型纤溶酶原激活物（t－PA）的问世使这类疾病得以治疗，但新的溶栓、抗栓药物的发现与研究仍是重要的医药学课题［1－4］。鉴于海洋生物活性物质自身独特的优点，如抗肿瘤、溶解血栓、抗菌等作用，海洋生物逐渐成为新药研发的珍贵资源［5－6］。本实验室经过多年对海洋无脊椎动物单环刺螠的探索研究，从其体内得到一种分子量为26kDa的纤溶酶，并对其溶栓活性进行了初步研究，报道了该酶溶栓效果优于蚓激酶，且具有直接降解血栓纤维蛋白的能力［7－8］。本文将对分离纯化得到的新组分UFEⅠ（45kDa）进行研究，初步评价其药效学作用及免疫原性，进一步丰富对单环刺螠体内活性物质的相关认识。

1 材料和仪器

1.1 实验动物与试剂

SPF级小鼠，购自青岛市药品检验所实验动物和动物实验中心；雄性Wistar大鼠购自山东省农业科学研究院；单环刺螠纤溶酶UFEⅠ冻干制剂（45kDa），本实验室制备；注射用尿激酶（Urokinase，25万单位），国药准字H21023278，辽宁天龙药业有限公司产品；牛血清白蛋白（Bovine Albumin，BAS），北京拜尔迪生物公司产品；羊抗小鼠IgG－HRP，博士德生物工程有限公司产品；弗氏完全佐剂（Freund’s complete adju－vant，FCA）和弗氏不完全佐剂（Freund’s incomplete adjuvant，FIA）均为Sigma公司分装产品；其它试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 主要仪器

TU－1800紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司产品；Mikro 22R离心机，德国赫提驰（Hettich）公司产品；BT87－2型体内血栓形成测定仪，包头医学院心血管研究室产品；Rayto 2100C酶标仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司产品；隔水式电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司产品。

2 方法

2.1 抗凝血及抗血栓作用研究

2.1.1 小鼠血液凝固时间实验［9］30只小鼠（体重18～20g），雌雄各半，随机分为5组，每组6只，设置阴性对照组（生理盐水），UFEⅠ低、中、高剂量组（8.4、16.8及33.6mg／kg），阳性对照组（尿激酶5 000 U／kg）。均由尾静脉注射给药，给药量为20mL／kg，给药10min后摘取小鼠眼球，分别用玻片和毛细管取血。玻片法以用干燥针头挑动血滴后出现丝状为凝血，毛细管法以折断毛细管后出现丝状为凝血。每15s观察1次，计算取血到出现凝血丝时间为全血凝血时间，记录各组凝血时间。实验组各剂量UFEⅠ的酶活力单位均采用纤维蛋白平板法，按照尿激酶活力单位标准曲线标定。

2.1.2 大鼠动脉血栓形成实验［10］30只雄性Wistar大鼠（体重250～300g），随机分为5组，每组6只。设置阴性对照组（生理盐水），UFEⅠ低、中、高剂量组（5.8、11.6及23.2mg／kg），阳性对照组（尿激酶3500 U／kg），均由大鼠股静脉给药，给药量为0.5mL／100g。腹腔注射3%戊巴比妥钠（1mL／kg）麻醉大鼠，剥离股静脉给药后，切开大鼠颈部皮肤，分离右侧颈动脉约15mm，将体内血栓测定仪的刺激电极及连接仪器的温度探头钩于动脉上，于给药后15min，打开仪器开关，通过刺激电极给予1.5mA电压刺激，以损伤动脉内皮细胞。随着动脉管腔内血栓逐渐形成，血流逐渐被阻断，则血管远端温度突降，监测血管表面温度变化，记录从刺激开始到温度突降所需时间，为血栓形成时间。另于给药后30min，腹主静脉取血2.7mL，加0.3mL柠檬酸钠（3.8%）抗凝，混匀后，检测PT－凝血酶原时间，APTT－活化部分凝血活酶时间，TT－凝血酶时间，FIB－纤维蛋白原含量。实验组各剂量UFEⅠ的酶活力单位均采用纤维蛋白平板法，按照尿激酶活力单位标准曲线标定。

2.2 UFEⅠ免疫原性实验［11］

将30只小鼠随机分为阴性对照组（生理盐水，NS）、阳性对照组（牛血清白蛋白，BSA）和实验组（单环刺螠纤溶酶，UFEⅠ），每组10只。各组待测样品溶液与等体积的弗氏完全佐剂（FCA）充分混合，经皮下免疫小鼠。1周后，同量的待测样品溶液与等体积的弗氏不完全佐剂（FIA）混合，经皮下加强免疫小鼠，每隔1周加强免疫1次，总共加强免疫2次，观察各组小鼠生长状况。从初次免疫开始，第7、14、21、28天小鼠尾采血，并于第35天摘眼球取血，分离血清，－20℃冻存备用。

2.2.1 血清抗体检测 从第1次免疫开始，每次免疫后1周，以及末次免疫后1周、2周和3周，即初次免疫后的第7、14、21、28和35天采血，分离血清，采用间接ELISA法测定小鼠体内抗体动态变化水平。

2.2.2 间接ELISA条件的建立 采用方阵法，将纯UFEⅠ做1、2、3……9、10μg／mL的稀释，包被酶标板，抗血清分别稀释10、20、40、80、160、320、640、1 280、2 560倍，进行间接ELISA试验，选择最佳抗血清稀释度和抗原包被量，并分别对包被条件、底物终止时间、抗血清、酶标二抗最佳反应时间、终止液浓度等条件进行优化。

2.2.3 UFEⅠ抗体效价测定 用已优化的ELISA条件，对抗血清进行OD450值的测定，确定血清中UFEⅠ的抗体效价。

将抗体效价定义为：免疫组和阴性对照组OD450比值（P／N值）≥2.0所对应的最大稀释倍数［12］。

2.3 统计学分析

3 结果

3.1 抗凝血及抗血栓作用研究

3.1.1 小鼠血液凝固时间实验 由表1可见，UFEⅠ低、中、高剂量组3个剂量均能明显延长小鼠血液凝固时间，与生理盐水组比较有显著性差异（p＜0.05），且随着UFEⅠ剂量的增加，血液凝固时间延长，表明该酶在小鼠体内具有抗凝血作用。UFEⅠ中剂量组（玻片法／毛细管法）与尿激酶组比较均无显著性差异（p＞0.05），说明相同酶活力单位（5 000U）的UFEⅠ和尿激酶的抗凝血作用效果相当。

表1 单环刺螠纤溶酶UFEⅠ对小鼠血液凝固时间的影响Table 1 Effect of UFEⅠon coagulation time in mice（珚x±s，n＝6）

3.1.2 大鼠体内血栓形成实验 与生理盐水组比较，UFEⅠ低、中、高3个剂量组均能明显延长大鼠体内血栓形成时间（p＜0.05），且随着UFEⅠ剂量的增加，血栓形成时间逐渐延长，表明该酶在大鼠体内具有抗血栓形成的作用。与尿激酶组比较，UFEⅠ高剂量组无显著性差异（p＞0.05），表明高剂量UFEⅠ（7 000 U）与尿激酶（3 500U）的抗血栓形成作用相当（见表2）。单环刺螠纤溶酶UFEⅠ对血凝相关生化指标的影响见表3。尿激酶组、UFEⅠ中、高剂量组分别与生理盐水组相比，均使FIB极显著降低（p＜0.01），尿激酶组与UFEⅠ组中、高剂量组比较无显著性差异（p＞0.05），表明此剂量UFEⅠ与尿激酶对降低纤维蛋白原含量作用相当。UFEⅠ组低、中、高3个剂量组可显著延长APTT（p＜0.05，p＜0.01），但对TT和PT无显著影响；APTT是反映凝血第一阶段内源性途径的指标，因此初步判断UFEⅠ可作用于内源性凝血途径。综上，UFEⅠ可以降低纤维蛋白原含量（FIB），并延长部分凝血活酶时间（APTT），依此可对该酶的具体抗凝血机理做进一步研究。

表2 单环刺螠纤溶酶UFEⅠ对大鼠体内成栓时间的作用Table 2 Effect of UFEⅠon time for thrombus formation in rats（珚x±s，n＝6）

表3 单环刺螠纤溶酶UFEⅠ在大鼠血栓模型中对APTT，FIB，PT和TT的影响Table 3 Effect of UFEⅠon PT，APTT，FIB and TT in carotid thrombosis test of rats（珚x±s，n＝6）

图1 免疫后各组小白鼠的抗体含量变化曲线Fig.1 Variation curves of antibody content in different groups post－immunization

3.2 UFEⅠ免疫原性实验

3.2.1 小鼠体内特异性抗体的动态变化 以纯UFEⅠ溶液包被酶标板，检测免疫后血清样品的特异性抗体含量。以采血时间为横坐标，OD450值为纵坐标绘制曲线，结果见图1。实验组小鼠在末次免疫后1周（即第21天）采血分离血清，间接ELISA法检测到产生了微量的特异性抗体，第28天检测到特异性抗体水平达到最大，随后在第35天出现下降趋势。抗体水平呈现先上升后下降的动态变化。而阳性对照组（BSA）免疫小鼠后产生的特异性抗体于末次免疫后7d明显提高，且抗体水平一直呈现上升趋势，第35天检测到OD450达到最大值。提示应用UFEⅠ免疫后可能刺激小鼠体内产生一过性抗体。

3.2.2 间接ELISA条件的选择 方阵结果显示，当抗血清做1∶10稀释，抗原包被浓度为2μg／mL时，所测定的OD450值接近1.0，且P／N最大，非特异性较低。据此，确定抗血清的工作浓度为1∶10，抗原最佳包被浓度为2μg／mL。其他优化条件为用含1%BSA的PBS（pH＝7.4，0.15mol／L），37℃封闭1h；待检血清用PBS稀释，37℃作用45min；酶标二抗按1∶5 000稀释，作用45min，底物终止反应进行15min时，用浓度为2mol／L的H2SO4溶液终止显色。

3.2.3 抗体效价的测定 根据已初步建立的ELISA条件，进行抗体效价的测定。在末次免疫后，小鼠体内产生了特异性抗体，并于末次免疫后1、2、3周出现先上升后下降的动态变化，根据免疫组与阴性对照组比值（P／N值）≥2.0所对应的最大稀释度为待测样品的效价，测得UFEⅠ免疫产生的抗体效价为1∶1 280（见表4）。

表4 纤溶酶UFEⅠ抗体效价的测定Table 4 Determination of antibody titers of UFEⅠ

3.2.4 免疫小鼠的生长状况 免疫期以及免疫后期的观察中，各组小鼠体重增长情况基本一致，但阳性组14d后体重有减缓增长趋势，并于免疫后期基本保持不变。对免疫后期各组小鼠体重进行统计分析，饲养末期实验组小鼠体重与阴性对照组比较无显著性差异（p＞0.05），生长状况一致，证明体内注射UFEⅠ对小鼠生长状况无不良影响（见图2）。

图2 各组小鼠体重的变化曲线Fig.2 Variation curves of body weight of mice in different groups

4 讨论

单环刺螠纤溶酶（UFEⅠ）对小鼠体内凝血时间的影响表明，该酶具有延长小鼠体内凝血时间的作用，且随剂量增加作用增强。应用大鼠颈动脉血栓模型研究该酶对血栓形成时间的影响，显示其具有显著延长大鼠体内血栓形成时间的作用。本文作者观察了给药后对大鼠PT、APTT、FIB和TT的影响，结果表明不同剂量的UFEⅠ均能降低血浆中FIB的含量，并可延长APTT，但对PT和TT无显著影响。在凝血系统的作用机制中，纤维蛋白原在凝血酶的作用下转变为纤维蛋白，直接参与凝血过程，还可介导血小板的聚集反应［13］，APTT可反映凝血第一阶段内源性凝血途径的状态。单环刺螠纤溶酶UFEⅠ对凝血因子的作用结果表明，其可能通过影响内源性凝血途径和血小板的聚集，以及其较强的纤溶活力发挥抗凝作用，抑制血栓的形成，具体机理有待进一步研究。

药物的免疫原性是指药物刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的性质。随着大量生物技术药物的研发，免疫原性的评价成为阐明这些药物临床安全性和有效性的关键因素［14］。初金鑫等［15］研究显示，单环刺螠纤溶酶UFEⅠ无溶血毒性，静脉注射安全性较高。作为一种潜在溶栓药物，有必要对其进行免疫原性研究。本文采用皮下多点多次注射免疫小鼠，间接ELISA法检测特异性抗体产生水平，结果表明末次免疫后1周开始出现特异性抗体，但水平较低，仅在血清稀释度为1∶10时出现阳性数值。末次免疫后第2周抗体水平有所提高，3周后下降，呈现先升高后下降的动态变化趋势，表现出一过性。根据免疫组与阴性对照组比值（P／N值）≥2.0所对应的最大稀释度为待测样品的效价，测得UFEⅠ（45kDa）免疫产生的抗体效价为1∶1 280，且与阴性对照组比较具有显著差异（P＜0.05），说明单环刺螠纤溶酶（UFEⅠ）可以使小鼠体内产生微量的特异性抗体，能刺激动物体内启动体液免疫，提高机体的整体免疫水平。与此同时，在实验过程中，实验组小鼠未出现异常反应，与阴性对照组小鼠的体重增长状况基本一致，说明单环刺螠纤溶酶（UFEⅠ）不属于毒素蛋白，对动物机能不造成负面影响。本研

究虽不能完全预测单环刺螠纤溶酶（UFEⅠ）对人的免疫原性反应，但对于其免疫毒性的研究可作为参考和提示。其他方面有待进一步精确深入的研究，以明确其对安全性评价的影响以及抗药物抗体对药物的活性，药物的清除等方面的影响。

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Pharmacologic Effects and Immunogenicity of Fibrinolytic Enzyme UFEⅠfrom Urechis unicinctus

LIU Wan－Shun，CHENG Hui－Zhong，HAN Bao－Qin，BI Qing－Qing，DONG Wen，GUAN Chi
（College of Marine Life Sciences，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

To study the anticoagulability and antithrombotic activity，and to evaluate the immunogenicity of fibrinolytic enzyme UFEⅠfromUrechis unicinctus，preliminary，the effects of anticoagulability and antithrombotic activity were observed by the the experiments of thrombolysin on coagulation time in mice and carotid thrombosis in rats respectively.The dynamic changes of IgG and the antibody titers were detected by ELISA method after immunizing the mice with UFEⅠ.The results inchicated that UFEⅠsignificantly prolonged the coagulation time in mice，and effectively inhibited thrombosis of rats in vivo.Moreover，the fibrinogen content（FIB）was decreased，whereas the activated partial thromboplastin time（APTT）was prolonged.In case of the injury experiment in mice，the specific antibody appeared after one week，which dynamic tendency of initial rising and later dropping.The specific antibody titer was to be 1：1280by the optimal ELISA method.Conclusion was achieved that UFEⅠpossesses significant effects on anticoagulability and antithrombotic activity，which induces a temporary rise of specific antibodies in mice，but does not affect adversely on animal bodies.

Urechis unicinctus；fibrinolytic enzyme；anticoagulability；antithrombotic activity；immunogenicity

Q178.53；Q599

A

1672－5174（2012）1－2－088－05

国家“十一五”重大专项（2009ZX09103－646）资助

2011－03－02；

2011－03－20

刘万顺（1950－），男，教授。E－mail：WanshunLiu＠hotmail.com

责任编辑 朱宝象