单抗类药物的免疫原性问题及其控制

董健

（上海赛金生物医药有限公司，上海201203）

单抗类药物的免疫原性问题及其控制

董健

（上海赛金生物医药有限公司，上海201203）

单抗类药物（单克隆抗体药物和受体-Fc融合蛋白药物）近年来在癌症和自身免疫性疾病等领域取得了显著的疗效。根据诱发的抗药物抗体的类型不同，单抗类药物的免疫原性可能导致不同的临床后果，直至影响单抗类药物的有效性和安全性。单抗类药物免疫原性的发生机制尚没有明确的定论，可能与多种因素有关，其中蛋白质多聚体对免疫原性有显著影响。根据“质量源于设计”的原则，从单抗类药物的分子设计和工艺设计出发，采取人源化改造、开发人类抗体、检测和控制产品中多聚体含量等，有助于降低单抗类药物的免疫原性，实现单抗类药物的有效性、安全性和可生产性之间的平衡。

单克隆抗体；融合蛋白；免疫原性；多聚体

1 单抗类药物的应用与免疫原性

单克隆抗体药物和诸如依那西普的受体-Fc融合蛋白药物（以下统称为“单抗类药物”），具备与特定生物学靶点精准结合的能力，为患者提供了更好的治疗选择，近年来在癌症和自身免疫性疾病等领域均取得了显著的疗效。全球已有数以百万计的患者使用单抗类药物，中国患者使用单抗类药物的数量近年也出现明显增长。

单抗类药物的原研药一般都来自欧美药厂，价格高昂。不过，一些重量级单抗类药物专利即将过期，为各国开发生物类似药（biosimilar）和生物仿制药（me-too biologics）提供了巨大的机遇。中国市场潜力巨大，发展单抗类生物仿制药，可以显著地降低单抗类药物价格，造福我国患者。我国“十二五”规划将大力扶持生物医药产业的发展，单抗类仿制药是各地发展生物医药产业的重点之一，会有越来越多的单抗类药物供我国医生、药师和患者研究和使用。

与其他药物一样，单抗类药物也有毒副作用，包括首次给药反应和免疫原性（immunogenicity）等。首次给药反应可能是由抗体Fc区介导，激活了细胞因子的释放。首次给药反应往往是暂时性的，会随着后续给药而消失[1]。而单抗类药物的免疫原性则是由患者机体产生的抗药物抗体引起，从而对单抗类药物的有效性和安全性产生不同程度的影响。

药物的免疫原性，通常是指其诱发抗药物抗体反应的能力。这种反应的分子基础是蛋白质降解后产生肽段（表位），如果这些表位被免疫系统识别为异源的，会诱导产生抗药物抗体。

所有的外源性蛋白，包括用于治疗的蛋白质药物，都有引起抗体形成的可能性[2]。单抗类药物与其他蛋白质药物一样，有在患者体内引起免疫应答的潜力，诱发产生抗抗体[3]，影响其有效性和安全性[4]。单抗类药物诱导产生的抗抗体包括阻断单抗类药物与靶点结合的阻断抗体和与单抗类药物结合导致其功能丧失或被清除的中和抗体等。

免疫原性有可能导致不同的临床后果。如果免疫原性诱发的抗抗体是中和抗体，则比非中和抗体更有可能导致药效降低。另外，免疫原性有可能引起温和或严重的不良反应。

早在20世纪90年代中期，即单抗类药物即将进入其临床应用的黄金时代之际，研究人员就已经非常关注免疫原性对单抗类药物的应用、药效和未来发展的影响[5]。例如，Norman DJ等于1993年指出，接受OKT3治疗的患者中，50%的患者产生了干扰OKT3与T细胞结合的阻断抗体[6]，对治疗效果有负面影响。其他的单抗类药物在取得良好治疗效果的同时，不同程度地遇到了过敏反应和抗-抗体反应（AAR），即人对外源免疫球蛋白的免疫反应，包括人抗鼠抗体反应（HAMA）、人抗嵌合抗体反应 （HACA）、人抗人源化抗体反应（HAHA）。这些反应有时会产生严重的临床后果。

无论是药品监管部门，还是从事单抗类药物原研药、生物类似药或生物仿制药开发和生产的制药企业，以及在临床上评价和使用单抗类药物的医生、执业药师和患者，都需要关注和了解单抗类药物的免疫原性问题。而且，不仅仅需要重视新上市单抗类药物的免疫原性评价，也需要重视已上市产品生产工艺变更或产品特性改进后的免疫原性评价。

欧美国家的药品监管部门已经发布过一些有关抗抗体临床评价的白皮书和指南，对免疫原性筛选框架给出了比较明确的界定。概言之，应在单抗类药物开发阶段进行风险分析，评估其免疫原性的发生概率和可能引起的不良反应的严重性，系统性地评估和降低其风险，考虑免疫原性对于药物的利益/风险平衡的整体性影响，从而提高药物开发的成功率[7]。

我国的“人用单克隆抗体质量控制技术指导原则”针对单抗药物的免疫原性问题也作出了具体规定，例如要求“尽可能选用一些不引起免疫球蛋白聚合、变性等的纯化方法及条件”，“多聚体应≤10%”，“单克隆抗体的临床前试验，包括免疫原性、稳定性、组织交叉反应性和效应功能”等。

2 引起免疫原性的原因

单抗类药物免疫原性的发生机制尚没有明确的定论，可能与多种因素有关，包括患者的遗传背景、疾病类型、蛋白质类型（鼠源或人源）、翻译后修饰、氧化或形成多聚体改变蛋白质的三维结构、给药途径、给药频率、疗程长短、药物的生产和贮存等。

单克隆抗体技术发展的早期阶段所采用的杂交瘤技术只能生产鼠源抗体，因此，20世纪80年代进入临床试验的80%的单克隆抗体都是鼠源抗体[8]。鼠源抗体可能诱导产生人抗小鼠抗体或人抗大鼠抗体[9-10]，有可能阻断或清除鼠源抗体的作用，对其疗效和影像学形成负面影响[5]。抗体结构及分子生物学方面的进展使得可以将一些鼠源抗体改造为嵌合或人源化抗体。噬菌体展示文库和转基因动物技术的出现，使得不需要鼠源抗体作为起点，就可以产生人类抗体（human antibody）。一般认为，依产生抗抗体的可能性顺序而言，鼠源单抗最强，其次为嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体，因此，一般认为人类抗体或人源化抗体比鼠源抗体安全，因此，2000年左右进入临床试验的单克隆抗体中，只有7%是鼠源抗体[11]。不过，即使是人源化抗体或人类抗体，亦有可能诱发抗药物抗体的产生，人源化抗体，如抗 CD3（teplizumab）[12-13]、抗CD52（阿伦单抗）以及阿达木单抗都曾诱导产生人抗人抗体[14]。

蛋白质的天然修饰（例如翻译后的糖基化）或人为修饰（例如PEG化）等也可能改变单抗类药物的免疫原性。给药途径对免疫原性亦有影响。药物在肌内注射时的免疫原性可能会低于静注或皮下注射时的免疫原性。如果注射的组织内抗原呈递细胞如树突细胞的数量比较少，则免疫原性的风险会比较低。疾病的类型、患者的状态以及先前给药或协同给药，亦会影响免疫原性。例如，阿达木单抗在与甲氨蝶呤协同给药时，只在1%的类风湿性关节炎（RA）患者中表现出免疫原性，与其单独给药时12%的不良免疫应答形成鲜明的对比[15-16]。

为得到高纯度、稳定、安全和有效的单抗类药物，需要经过复杂的生产工艺和比较长的生产周期。生产工艺的各个步骤，包括细胞培养、纯化、制剂及成品的贮存和操作，以及西林瓶或预充注射器和胶塞等内包材在内的因素，都有可能影响免疫原性[17]。如果产品和工艺开发不完善，生产工艺不稳定，加上蛋白质在体外的不稳定性，可能会引起生物学活性变化，增强其免疫原性，影响成品的有效性和安全性。因此，在关注单抗类药物的免疫原性时，需要仔细监控生产工艺的每一个步骤，包括制剂和包装这些看起来重要性低于细胞培养和纯化的生产步骤。另外，在引入任何产品和工艺变更时，都必须仔细考虑是否会影响单抗类药物的免疫原性[18]。

例如，过去曾发现内包材与药物相互作用，影响了蛋白质药物促红细胞生成素（EPO）的免疫原性[19-20]。在EPO制剂配方中加入吐温80（polysorbate 80）后，发现出现再生障碍性贫血的患者比例上升。经调查，发现吐温80与预充注射器的未覆膜胶塞发生作用，产生有机析出物。小鼠实验发现这些析出物具有佐剂的作用，增强了EPO成品的免疫原性。后来，改用FluroTec覆膜的胶塞，避免了有机析出物的产生，结合其他降低风险的措施，降低了抗体介导的纯红细胞再生障碍的发生比例。

以上实例表明，在变更制剂配方时，必须避免由此造成对安全性和有效性的不良影响。另外，单抗类药物的生产厂家，在内包材选型时，应考虑采用优质内包材。内包材如西林瓶或预充注射器，及其用于密封的胶塞等，直接与药品接触，内包材的玻璃表面、空气-液体界面及润滑剂等可以介导蛋白质变性，而胶塞则可能包含对药品有不良影响的提取物和析出物，可能影响药效和免疫原性。因此，各国药品监管当局将内包材的变更视为高风险变更。国内优质生物仿制药如强克○R等，就采用了质量一流的西林瓶与胶塞，为药品质量提供了必要保证。

在单抗类药物的开发与生产中，还需要关注蛋白多聚体等因子对免疫原性的影响[21]，因为过往的研究表明，多聚体是导致免疫原性的重要因素之一。蛋白质多聚体是由天然或变性单体组成的多体构成的高分子量蛋白质。在不同的环境中，多聚体的形成有可能是可逆或不可逆的，可以是可溶性或不溶性的。

在研究不依赖T辅助细胞的抗体应答时，Dintzis RZ等[22]认为B细胞的刺激信号必须以足量的方式呈现，使得细胞表面表达的抗原受体，以超过一定数量的紧密相连的簇的形式构成一个 “免疫子”（immunon）；构成这种刺激信号的多聚体分子量不能低于100 kDa，且半抗原价数不得低于10。后续的研究工作表明，B细胞激活和抗体产生不仅仅依赖于分子量和半抗原价数，亦有赖于半抗原亲和性、多聚体牢固性和结合动力学[23]。

Bachmann MF等[24]指出，疏松的多聚体可以诱导依赖T辅助细胞的抗体产生，而高度结构化的病毒壳体可以在没有T细胞辅助的情况下诱发抗体的产生，清楚地证明了高度结构化的蛋白质多聚体在诱发快速和有效的免疫应答方面的能力。Rosenberg AS[25]认为，处于高度阵列结构中的蛋白质抗原，例如那些在非还原多聚体中的蛋白质抗原，可以在没有T细胞辅助的情况下，诱导抗体的产生。多价蛋白质可以交联B细胞受体，通过Bt激酶激活B细胞进行增殖，将蛋白质导向Ⅱ型主要组织相容性复合体（MHC）的装载腔室，有效地诱发T细胞辅助的抗体应答。

以上研究工作表明，高分子量的聚集抗原阵列可以高效地诱导不依赖T细胞辅助的抗体应答，而结构松散的聚集抗原可能需要T细胞辅助才能产生免疫应答。总之，一般认为形成多聚体的蛋白质比天然蛋白质更容易被免疫系统识别。

半个多世纪以来，随着静注免疫球蛋白和人生长激素（hGH）的临床应用，已经对蛋白质多聚体与抗体介导的不良反应之间的关系有了清晰的理解，认识到蛋白质多聚体可以增强针对蛋白质单体的免疫应答能力。

例如，20世纪50至60年代在啮齿类实验动物中注射人免疫球蛋白的研究表明，通过去除人免疫球蛋白制备物中的高分子量成分，可以消除对人免疫球蛋白制备物的免疫应答[26]。研究表明，这种抗体应答，对多聚体特有的决定簇（即仅由高级结构呈现）或在变性蛋白质多聚体表面暴露出来的隐蔽决定簇有特异性[27]。又例如，hGH的临床应用表明，那些使用较高含量多聚体的hGH患者的抗hGH抗体持续存在，而使用较低含量多聚体的患者仅有短暂的抗体应答[28]。重组白介素-2（IL-2）是以多聚体的形式进行配制的，平均每个多聚体内含有27个单体IL-2，大多数的多聚体分子量超过100 kDa且含有超过20个以上的配体，因此该产品具有高度的免疫原性，在80%～100%的患者中诱发了结合抗体应答[29]。

因此，为降低蛋白质药物（包括单抗类药物）的免疫原性，有必要确保蛋白质天然构象的稳定性，避免高分子量多聚体的形成。

3 评价免疫原性的方法

鉴于免疫原性对单抗类药物有效性和安全性的不良影响，有必要采取措施，对处于研发阶段和临床应用阶段的单抗类药物的免疫原性进行评估和筛选，为规避或控制单抗类药物免疫原性所带来的风险提供依据。

通过检测动物或患者体内抗抗体等生物学分析方法，可以评估生物制品的免疫原性[30]。一般认为，传统的动物模型如猕猴、兔子、大鼠或小鼠，预测免疫原性的能力有限，临床试验是最好的评估免疫原性的方法。未来需要开发专门设计的动物模型，包括灵长类动物和转基因小鼠，预测新单抗类药物的免疫原性。

研究人员也在尝试采用计算机（in silico）筛选法[31]，以及检测T细胞应答的体外检测方法评估单抗类药物的免疫原性。计算机筛选法，就是采用免疫信息学的运算法则，鉴别和计算形成免疫原性的主要因素T细胞表位的数量。例如，将蛋白质序列分成重叠的9个氨基酸的肽段框架，评价每个肽段与覆盖绝大多数人类遗传背景的8个常见Ⅱ型人类白细胞抗原（HLA）的结合能力，得到蛋白质药物的“免疫原性分数”，并据此将蛋白质药物的免疫原性风险进行分级，有利于在临床前阶段预判新药的临床免疫原性风险。

鉴于蛋白质多聚体是增强免疫原性的重要因素之一，需要在生产过程、中间产品和成品中监测与控制多聚体含量。一般通过分子尺寸排阻高效液相色谱法（SEC-HPLC）检测产品中的蛋白质多聚体，该方法具有灵敏度高的特点，但是也有缺陷，例如某些高分子量的多聚体可能不能通过，因此，应采取与SEC-HPLC正交的方法予以补充，例如光学、荧光和电子显微镜术，浊度法，质谱法，电泳法，UV-VIS光谱法，红外光谱法，荧光光谱法，圆二色谱法（CD），核磁共振等。

4 降低免疫原性的方法

可根据“质量源于设计（QbD）”的原则，从单抗类药物的分子设计和工艺设计出发，降低单抗类药物的免疫原性，实现单抗类药物的有效性、安全性和可生产性之间的平衡。下面介绍了几种通过分子设计和工艺设计降低单抗类药物免疫原性的策略。

人源化技术，即将鼠源单抗的恒定区及可变区的框架区用人类序列替换，可以实现鼠源单抗的人源化改造，从而显著地降低免疫原性[11，32]。而转基因小鼠和噬菌体展示等技术，使得可以选择与人类种系序列高度同源的抗体序列，以降低免疫原性的风险。即便如此，局部人源化的单抗，甚至完全人源化单抗仍然有免疫原性风险[32]。

降低免疫原性的另一种思路是“去免疫化”，即通过去除T细胞表位，避免与HLA结合。这种思路与肿瘤细胞或其他病原体逃避宿主免疫系统攻击的方式相类似。

如前所述，蛋白质多聚体对免疫原性有重要影响。多聚体在单抗类药物的生产、贮存、运输和向患者交付的过程中都有可能形成，因为这些过程中的各种物理和化学因子都有可能诱导多聚体形成，包括温度波动、光照、摇晃、表面效应、pH调整等[33-34]。形成的多聚体直径从几纳米到几毫米不等。如果形成多聚体的根源没有消除，则除菌过滤不会起到去除多聚体的作用，因为多聚体会在除菌过滤后再次形成[35]。因此，可在产品和工艺开发阶段，按照QbD的原则，深入研究和开发单抗类药物的细胞培养、纯化、制剂工艺条件，包装和贮存条件，避免或尽量减少蛋白质多聚体的形成。

例如，UCB公司改进了新单抗药物的纯化工艺，减少了多聚体的产生，结合新的制剂配方，使得在用药96周后，产生中和抗体的患者比例降低了20%[36]。又如，我国新近批准的单抗类生物仿制药如强克○R

，在细胞培养和纯化工艺开发上借鉴了国际先进理念、先进技术，在纯化工艺中不但设计了去除多聚体的工艺步骤，而且使用了性能稳定、技术先进的层析填料，有效地减少和控制了多聚体含量。其纯度和大分子量物质（多聚体）的标准比之前批准的同类产品的质量标准更为严格，体现了我国单抗类药物生产技术和质量管理水平的进步。

需要注意的是，无论怎样优化生产工艺、配方和贮存与运输条件，都不可能彻底地去除或避免多聚体的产生。另外，还需要建立稳定灵敏、重复性好的定量检测多聚体的方法，例如SEC-HPLC和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳/SDS-毛细管电泳（CE-SDS），用于监控生产过程中间体、原液和成品的纯度和多聚体水平，从而降低由其引起的免疫原性。

5 结论

单抗类药物近年来在癌症和自身免疫性疾病等领域取得了显著的疗效和广泛的应用。与其他药物一样，单抗类药物也有毒副作用，包括首次给药反应和免疫原性等。根据诱发的抗药物抗体的类型不同，免疫原性有可能导致不同的临床后果，直至影响单抗类药物的有效性和安全性，值得药品监管部门、制药企业、医生和执业药师、患者关注。免疫原性的发生机制尚没有明确的定论，与多种因素都可能有关系，其中蛋白质多聚体对免疫原性有显著影响。根据QbD的原则，从单抗类药物的分子设计和工艺设计出发，采取人源化改造、开发人抗体、检测和控制产品中多聚体含量等，有助于降低单抗类药物的免疫原性，实现单抗类药物的有效性、安全性和可生产性之间的平衡。

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The Immunogenicity and Control of Therapeutic Monoclonal Antibodies

Dong Jian(Shanghai Celgen Biopharmaceutical Co.，Ltd.，Shanghai201203，China)

Therapeutic monoclonal antibodies and receptor-Fc fusion proteins have exhibited excellent efficacy in the treatment of cancer and autoimmune diseases.The immunogenicity of these biotherapeuticsmay impact their safety and efficacy profile，depending on the nature of the anti-drug antibodies elicited.The exact mechanism of such immunogenicity is unclear， however， it is associated with many different inherent and external conditions.Protein aggregates have been known contributing to immunogenicity.Rational design of molecular sequence and production process under the guidance of Quality by Design，including the development of humanized antibody and fully human antibody， and quantification and control of protein aggregates of the drug product， w ill help to reduce or eliminate immunogenicity and keep the balance between efficacy，safety and manufacturability of such biotherapeutics.

Monoclonal Antibody；Fusion Protein；Immunogenicity；Aggregates

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.09.004

董健，男，生物学硕士，工商管理硕士，制药高级工程师。研究方向：生物制品生产及质量管理。E-mail：dongjian2005@gmail.com

2012-05-02）