基于分子动力学模拟研究P53-DNA结合域单点突变对肽段的影响

许朝莹

（山东师范大学物理与电子科学学院 山东 济南 250014）

0 引言

P53作为最重要的抑癌基因之一，与癌症的发生发展联系紧密，大约50%的人类癌症中存在着P53突变。P53定位于人类17p13.1染色体上，由11个外显子和10个内含子组成，能编码与核DNA结合的磷蛋白P53。人类P53蛋白由393 个氨基酸组成，有三个功能区:（1）N 端区域(1～94)；（2）中间疏水区域 (94～297，DNA Binding Domain，DBD)；（3）C 端区域(297～393)。DBD区域能直接与DNA结合，绝大多数肿瘤中检查到的P53突变即发生在该区域中，由两个反平行折叠片构成一个三明治样的片层骨架结构。该区域有四个保守区域，分别记为Ⅱ-Ⅴ。Ⅳ(234-255)能直接和DNA结合，单独存在时没有严格的二级结构，呈无规则卷曲状。迄今为止，对P53区域Ⅳ突变结构及生理功能缺乏深入系统的认识，对该肽段与肿瘤致病微观机制的联系尚不清楚。

P53蛋白残基的点突变、缺失以及失活在癌症的发生和发展过程中起着关键性的作用。Assaf Friedler等用NMR技术研究R249S突变对P53结构的影响，发现突变体的结构与野生态结构类似，但是β三明治片层骨架结构的柔性增加，DNA结合平面发生局部弯曲。Oded Suad等利用实验检测R249S、R249S/H168R和R249S/H168R/T123A突变对P53转活功能的影响，发现R249S突变使DBD区域结构发生变化，与DNA、蛋白质之间的相互作用消失；R249S/H168R突变能稳定P53-DNA结构，能部分恢复P53的转活功能；R249S/H168R/T123A突变进一步增强结构的稳定性。

尽管实验生物学对P53突变作了大量研究和统计，对R249残基突变影响P53结构也进行了一些研究。但是，在原子水平，P53蛋白及其突变区域的构象如何变化？与肿瘤致病微观机制有何联系？尚没见到有关报道。本文利用分子动力学模拟方法，研究R249S突变对P53-DNA结构的影响。分别对野生型wtP53肽段和单点突变P53-R249S进行独立的分子动力学模拟，每组模拟300ns。该研究为从分子层次认识肿瘤的致病机制和设计新的治癌药物奠定理论基础。

1 方法

P53蛋白的R249残基位于DBD保守Ⅳ区域（残基234-255），选取残基230-258肽段作为研究对象。分别对wtP53肽段和单点突变P53-R249S肽段两个体系进行分子动力学模拟，wtP53肽段的初始结构取自蛋白质结构数据库（代码为1tsr），R249S突变利用Swiss-pdbviewer软件实现。

利用GROMOS软件和43A1力场，分别对上述体系在NTP系综下进行分子动力学模拟。带电基团选用残基在pH值为7.2下的质子化状态，选用SPC水模型，选择周期性大小合适的十二面体盒子，溶质同盒子边缘最小间距设定为0.8nm。静电作用力用PME计算，其库伦力阈值定为0.9，范德华相互作用力的势能距离阈值定为0.9。为使模拟体系保持电中性，wtP53肽段体系加入一个氯离子，P53-R249S体系呈现电中性，不加任何离子。能量优化后，约束溶质原子，进行300ps的约束动力学模拟，将体系温度由50K平衡升到300K。使体系均保持在温度300K、压强1bar，采用弱耦合作用保持体系的温度和压强稳定，温度和压强的耦合时间常数均为0.1ps，模拟步长为2fs，进行300ns的自由动力学模拟，每2ps采集一次构象。

2 结果与讨论

为深入探索生理环境条件不同残基突变对P53肽段构象稳定性的影响，我们计算二组体系的自由能分布和聚类情况。

利用GROMACS的两个程序g_covar和g_anaeig对模拟构象进行主成分分析，选取两个最大主量PC1和PC2为反应坐标，根据构象分布，用二维直方图法分别计算二个体系的自由能。自由能定义为-kTlnP(PC1,PC2)，其中，k和T分别为波尔兹曼常数和温度，P（PC1,PC2）为两个主量的联合概率分布。在图中，颜色越深，表明相应自由能越低、结构越稳定，构象落到该区域的概率就越大。不同残基突变对结构有不同的影响。单点突变型P53-R249S肽段的自由能较低，而野生型P53肽段有一个相对稳定的中间态结构。

对体系进行构象聚类(Conformation clusters)分析，确定采样构象的倾向。构象聚类基于构象之间骨架原子位置的根均方差(Root mean square deviation,RMSD)。在模拟最后100ns输出的轨迹中，等间隔均匀选取1×104个构象作为分析对象，基于构象之间的根均方差进行聚类。聚类的标准是，如果一个构象同某个类里面的任一构象之间的根均方差小于0.1nm，那么这个构象就属于该类。通过聚类发现，单点突变型P53-R249S肽段的中心构象有α螺旋结构，而野生型P53肽段只有β片结构。

3 结论

P53残基突变是肿瘤病发的重要因素。为了研究R249S突变对结构的影响，本文选取P53残基230-258肽段为对象，利用分子动力学模拟研究其突变对P53肽段的影响。采用GROMACS软件包、43A1力场和充分含水模型，在生理条件下分别对肽段wtP53和单点突变P53-R249S进行300ns的独立分子动力学模拟，研究R249S突变对结构的影响。结果表明:单点突变P53-R249S肽段自由能较低，无中间态，而野生型P53肽段有一个相对稳定的中间态。从原子水平上揭示单点突变P53-R249S肽段和wtP53肽段构象差异的动力学和热力学特性，能更好地理解由P53残基突变引起肝癌的微观致病机制，为新药物设计提供启迪。

［1］Attardi,L.D.;Donehower,L.A.Mutat Res.2005,576(1-2),4.

［2］Soussi,T.Adv Cancer Res.2011,110,107.