光纤共聚焦显微内窥镜活体内实时成像系统的设计和研究＊

殷 刚，周 军

（1.上海波汇通信科技有限公司，上海 201204；2.上海理工大学 光电信息与计算机工程学院，上海 200093）

引 言

众所周知，肿瘤是致使人类病亡的第二大病因，全球每年癌症死亡人数约为700万人。在现代医学中，临床上肿瘤诊断的主要手段是活体组织切片，据统计数据表明，全球每年有上亿次活体组织切片诊断，一般过程是用穿刺等方法在身体内取出活的组织切片，然后在显微镜下作病理诊断。此种方法给患者造成极大的痛苦，患者依从性较差，并且每次诊断需数天时间，医疗成本较高，此外制成的切片使细胞失去了生理状态，影响诊断准确度。与此同时，X光摄片、计算机X射线断层扫描技术（computed tomography，CT）、光学相干层析技术（optical coherence tomography，OCT）和核磁共振成像技术（magnetic resonance imaging，MRI）等医学影像学技术已经成为疾病诊断的常规手段，大大加快了诊断时间。但是，现有成像技术的分辨力较低，在癌症初期阶段，肿块较小不明显，现有成像技术由于分辨力限制很难实现肿瘤的早期诊断，从而错过了癌症治疗的最佳时期，给患者造成巨大的损失。

上述实际应用需求客观上推动了结合医学影像学技术的快速发展以及适合活体组织切片的高分辨力光纤共聚焦显微镜的研究开发。光纤共聚焦显微镜的光载体与医用软性纤维内窥镜一样，都是玻璃光纤，因此具有良好的柔软性和方便的操作性能。光纤共聚焦显微镜的优势在于它实际上是一种共聚焦显微镜：不仅用激光光源代替了纤维内窥镜的冷光源，而且具有复杂的光学成像子系统，即三维扫描系统、光束分离器、用于反射激光聚焦的小孔和一系列校正透镜组。现有的光纤共聚焦显微镜已达微米级光学分辨力，完全可以实现对组织细胞进行细胞级和亚细胞级的微观成像。目前，光纤共聚焦显微镜正处于技术发展初期［1－2］，国外商业化的产品有Opticscan公司的Optiscan FIVE1和 Mauna Kea Technologies公司的Cellvizio LAB光纤共聚焦显微镜，国内的工作主要集中在理论研究［3－5］和皮肤共聚焦样机的研制［6－8］，尚无此类产品。

文中重点开展了光纤共聚焦显微内窥镜活体内实时成像系统的研发，主要包括光纤共焦显微镜和图像处理子系统。在光纤共焦显微镜中，通过激光光源代替冷光源，光纤束传输图像，同时自主设计光学结构，在提高图像分辨力的前提条件下，减小物镜端头的物理尺寸，以达到活体成像的实际要求。在图像处理子系统中，通过线性、非线性图像匹配和反卷积算子增强等独特算法提高图像的重构质量。

文中采用光纤共焦显微技术，结合独特的图像重构技术，克服了现有技术的缺点，具有图像分辨力高、探头物理尺寸小、实时检测等多方面优势。

1 共聚焦显微镜简述

共聚焦概念最早由美国学者Marvin Minsky提出，当时Minsky在哈佛大学读博士后，期间提出了共聚焦显微镜的基本概念［9］。1955年，Marvin Minsky利用共焦原理搭建了一台共焦显微镜，用来观察大脑的神经元网络，并于1957年申请了技术专利［10］。但在当时，Minsky的发明并没有马上引起人们的注意，主要原因是没有足够强度的光源，并且当时计算机的能力还不足以处理大量的数据。随着60年代激光的问世，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜在1970年问世。到了90年代，光学和电子技术的发展产生了更稳定和更强的激光、更高效的扫描镜片组、更高效能的光纤、更精细的镀膜技术和更低噪音的检测器。此外，更多的适合固定波段激发的荧光染料也被不断地合成，1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到清晰的图像；商业计算机处理器速度快速发展，图像显示技术提高和大容量存储设备的产生也推动了共聚焦显微镜的发展［11］，1987年，BIO－RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜。1993年Gmitro和Aziz首次提出了利用光纤束传输扫描的图像平面和扫描光纤束近端面的光栅，在焦平面上产生样品的表面图像，根据这种思路，光纤共聚焦显微内窥镜的研究正不断地进行，而且也取得一些很好的结果。

2 光纤共聚焦显微内窥镜活体内实时成像系统

2.1 共聚焦显微镜的工作原理

如图1所示：探测光通过小孔后成为点光源，经透镜聚焦到被观测样品上，如果样品恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当聚焦回到点光源处，这就是所谓的共聚焦。共焦显微镜在反射光的光路上加上了一块半透半反镜，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个针孔，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光探测器。探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光探测器探测到的就是焦点处的反射光强度。

图1 共聚焦工作原理Fig.1 The principle of confocal

2.2 光纤共聚焦显微内窥活体实时成像系统

在传统共聚焦显微镜的基础上，引入高速扫描振镜和超细传像光纤束，构成光纤共聚焦显微内窥活体实时成像系统，是癌症早期诊断的重要工具，系统创新点有：

（1）采用激光光源替代传统的冷光源，提高系统的光学分辨力；

（2）采用超细成像光纤束传输图像，便于活体成像；

（3）物镜成像系统中引入集成化光学设计，大大减小其尺寸；

（4）图像拼接技术采用了微分几何的大尺度形变理论，消除全景图像的几何畸变，实现高分辨力显示；

（5）针对具体医学诊断图像形态进行统计分析，大大减少诊断医生的人工介入。

图2是光纤共聚焦显微内窥活体实时成像系统的光路图，该系统包括有：激光光源照明系统、分光棱镜、高速扫描振镜、扫描透镜、超细传像光纤束、物镜、光纤共聚焦光谱分析系统和图像分析与重构系统。光源照明系统提供的激光光源进入至共聚焦扫描单元，扫描单元起到光路扫描的作用；从扫描单元出射后，经过扫描透镜组耦合至超细传像光纤束内的单根光纤，此单根光纤不仅起到传输光的目的，同时起到小孔的作用；光从此光纤出射后传输至物镜，再由物镜出射至探测样品上。探测样品上产生的荧光再通过物镜、超细传像光纤束、扫描透镜组、共聚焦扫描单元和分光棱镜传输至光纤共聚焦光谱分析系统内，再通过主机内的图像分析与重构系统完成图像重构。光纤共聚焦显微内窥活体实时成像系统能够提高生物影像的图像分辨力，同时重构的图像更接近于细胞组织真实的结构和状态。该系统横向分辨力取决于传象光纤束内相邻光纤的间距和物镜的放大倍数［12］，其关系如下：

图2 光纤共聚焦显微内窥镜活体内实时成像系统光路图Fig.2 Optical system of in vivo real－time fiber confocal endomicroscopy imaging system

式（1）中，d为横向分辨力，i为成像光纤内相邻光纤的间距，m为物镜放大倍数。

图3 光纤共聚焦显微内窥镜活体内实时成像系统框图Fig.3 Block diagram of in vivo real－time fiber confocal endomicroscopy imaging system

图3为光纤共聚焦显微内窥镜活体内实时成像系统框图，其中，激光器波长为405nm，该波长的近紫外光能激发荧光探针，便于观察组织结构。超细的成像光纤束采用了日本藤仓公司的FIGH－10－500N，该成像光纤由10 000根光纤有序排列组成，其直径仅为0.6mm。由于采用了超细的成像光纤束，在临床上可以利用人体的自然管道进入人体，达到肿瘤早期诊断的目的，并可以明显减少病人的不适感。为了得到组织结构的实时三维重构图，需要对组织结构采用三维高速扫描技术。该系统中，对于二维断层横向扫描，采用快速振镜结合慢速振镜，达到实时成像的目的，纵向扫描采用水压控制系统。快速振镜采用Cambridge Technology公司的CRS系类的谐振性快速扫描振镜，其谐振频率为8 000Hz，慢速振镜采用Cambridge Technology公司6230H型振镜。图4为光纤共聚焦显微内窥镜活体内实时成像系统观察到的老鼠结肠黏膜细胞。

图4 老鼠结肠黏膜细胞Fig.4 Colonic mucosa cell of a mouse

3 结 论

光学探测技术不断地应用到临床医学的活体组织病理学实时检测中，传统的共聚焦显微镜能在细胞水平上观测组织结构，可以应用到如皮肤、牙齿等组织结构。但是，由于其形态特征，不能进入体内，所以不能对体内的组织成像和不能为肿瘤的早期诊断提供依据。现研发的光纤共聚焦显微内窥活体内实时成像系统采用超细的光纤束传输图像和高速扫描振镜，同时自主设计光学结构，在提高图像分辨力的前提条件下，减小物镜端头的物理尺寸，以达到对体内活体组织的实际成像要求。图像处理可提高图像的重构质量，系统具有图像分辨力高、探头物理尺寸小、实时检测等多方面优势。

［1］许险峰，徐锡金，霍 霞.共聚焦激光扫描显微镜技术［J］.激光生物学报，2003，12（2）：156－159.

［2］张 旭，徐维奇.激光扫描共聚焦显微镜技术的发展及应用［J］.现代科学仪器，2001（2）：21－23.

［3］刘 勇，陈家璧.一种光纤共聚焦系统轴向光强的测量［J］.仪器仪表学报，2006，27（2）：1105－1106.

［4］刘 勇，陈家璧.探头对共聚焦内窥成像系统层析能力的影响［J］.光子学报，2008，37（6）：1152－1155.

［5］范慧敏，刘文文.基于像散原理的并行共聚焦探测曲线灵敏度研究［J］.光学仪器，2011，33（3）：71－76.

［6］葛华勇，陈 光，王保华，等.内窥式共聚焦成像系统分析［J］.光子学报，2007，36（7）：1198－1201.

［7］吴 萍，吕晓华，易秋实，等.内窥式散斑类共聚焦系统层析能力分析［J］.光学学报，2007，27（7）：1245－1248.

［8］陆春光，王立强，陆祖康.双波长激光共聚焦生物芯片扫描仪的研制［J］.光学仪器，2005，27（5）：123－127.

［9］MINSKY M.Memoir on inventing me confocal scanning microscope［J］.Scanning，1988（10）：128－138.

［10］MINSKY M.Microscopy apparatus：US，3013467［P］.1961－12－19.

［11］WHITE J G，AMOS W B.Confocal microscopy comes of age［J］.Nature，1987（328）：183－184.

［12］CHEN L，DESCOUR M.Fiber confocal reflectance microscope for in－vivo imaging［J］.Optics Express，2001，9（13）：821－830.