虾夷马粪海胆CYP51基因cDNA的克隆及其SNPs分析

仇雪梅吴领知郭晓黎张伟杰丛玉婷

常亚青1、2,宋坚1、2,刘洋2,王秀利2

(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023;2.大连海洋大学水产与生命学院,辽宁大连116023)

虾夷马粪海胆CYP51基因cDNA的克隆及其SNPs分析

仇雪梅1、2,吴领知2,郭晓黎2,张伟杰1,丛玉婷2,

常亚青1、2,宋坚1、2,刘洋2,王秀利2

(1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室,辽宁大连116023;2.大连海洋大学水产与生命学院,辽宁大连116023)

采用RT-PCR、PCR-SSCP等分子生物学技术和关联分析等方法对虾夷马粪海胆StrongylocentrotusintermediusCYP51基因的cDNA序列进行了克隆和单核苷酸多态性分析。结果表明:虾夷马粪海胆的CYP51基因包括一个1 491 bp的开放阅读框,编码496个氨基酸;其开放阅读框的第161个核苷酸处存在1个单核苷酸多态性,即核苷酸发生了A→G突变。关联分析结果表明,该单核苷酸多态性与虾夷马粪海胆的体质量、性腺质量之间存在显著相关性 (P＜0.05)。本研究中首次克隆了虾夷马粪海胆CYP51基因的cDNA序列并进行了SNPs分析,研究结果可为虾夷马粪海胆的分子标记辅助育种提供参考。

虾夷马粪海胆;CYP51基因;克隆;单核苷酸多态性

细胞色素P450基因家族编码的酶系在内源性物质 (如激素)和外源性物质 (如药物、环境化合物)的代谢过程中起着重要作用[1]。CYP51基因是P450超基因家族重要的成员,它是P450家族中唯一广泛分布于各种真核生物,甚至是一些原核生物中的成员[2-4]。CYP51基因编码的14α-去甲基酶是甾醇合成过程中的关键酶之一[5]。该酶的主要功能是催化甾醇前体14α-甲基羟基化的反应,生成的终产物在动物中为胆固醇,在真菌中为麦酵素,在植物和原生动物中为多种24-烷基化和烯烃化甾醇[6]。在哺乳动物体内,14α-去甲基酶的直接产物FF-MAS,不仅是胆固醇合成过程的中间产物,更是被确定为促减数分裂甾醇 (meiosis-activating sterol,MAS)[7]。减数分裂是动物有性繁殖过程中生成单倍体配子的关键步骤,因此,MAS在性腺中的合成、分布及其与单倍体配子生成的关系已经成为CYP51基因研究的一个热点。

与其它物种相比,棘皮动物CYP51基因的研究并不是很深入。而对于海胆这种以性腺为主要经济性状的动物来说,生殖细胞形成、成熟过程的调控对性腺的发育分化,甚至整个个体生长发育的影响极有可能更为突出。虾夷马粪海胆Strongylocen-trotusintermedius又称中间球海胆,原产于日本北海道及俄罗斯萨哈林岛等地,因其性腺色泽好、味甜、经济价值高、国际市场需求量高,中国于1989年从日本引进了该品种。目前,虾夷马粪海胆已经成为中国重要的经济海胆之一,发展前景良好。本研究中作者首次克隆了虾夷马粪海胆的CYP51基因,并进行了该基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNPs) 与壳高、壳径、性腺质量、体质量等生长性状的关联性分析,为进一步明确CYP51基因的功能,以及为虾夷马粪海胆的分子标记辅助育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验动物:虾夷马粪海胆由大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室提供,26月龄,共180个。

主要试剂:rTaq DNA聚合酶、dNTPs、MMLV反转录酶、RNA酶抑制剂、PMDT-19载体、DNA切胶回收试剂盒等均购自宝生物工程 (大连)有限公司;Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 生长性状的测定 测定虾夷马粪海胆的壳高、壳径和体质量等生长性状后,取性腺,测定性腺质量,并将性腺迅速放入冰箱(-80℃)中保存。

1.2.2 总RNA的提取和cDNA第一链的合成 取虾夷马粪海胆性腺组织100 mg,按照Trizol总RNA提取试剂说明书所提供的方法进行总RNA的提取,并用15 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA。对提取的RNA,按照试剂盒说明书所提供的方法用M-MLV反转录酶和随机引物合成cDNA第一链。

1.2.3 虾夷马粪海胆性腺基因组的提取 采用常规酚氯仿法抽提虾夷马粪海胆基因组DNA,用TE缓冲液溶解,并在4℃下保存。

1.2.4 引物合成和PCR扩增 从美国国立生物技术信息中心 (NCBI)网站上下载紫球海胆Strongylocentrotuspurpuratus等几个不同物种的CYP51基因序列。根据保守区域和紫球海胆CYP51基因非编码区序列,设计出3对引物用于CYP51基因的克隆 (表1)。引物由宝生物工程 (大连)有限公司合成。

表1 用于RT-PCR扩增的CYP51基因引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in RT-PCR am p lification of CYP51 gene

在获得虾夷马粪海胆CYP51基因的cDNA序列后,对其外显子部分设计了7对适于PCR-SSCP分析的引物,用于SNPs分析 (表2)。

表2 用于PCR-SSCP分析的CYP51基因引物序列Tab.2 Sequences of the primers used in PCR-SSCPCYP51 gene analysis

PCR反应体系共25μL,包括:模板DNA 1 μL,上、下游引物各 1μL,10×PCR 缓冲液(Mg2+plus)2.5μL,dNTPs 2μL,rTaq 0.5μL,用ddH2O补至25μL。PCR反应程序为:95℃下预变性5 min;94℃下变性30 s,退火 (退火温度如表1和表2所示)45 s,72℃下延伸30 s,共进行30个循环;最后在72℃下延伸7 min。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的质量,以决定下一步SSCP试验中的用量。

1.2.5 PCR-SSCP分析[8]在干净的PCR管中加入5μL上样缓冲液 (98%甲酰胺,0.025%酚蓝, 0.025%二甲苯酚,2%甘油,10 mol/L pH为8.0的EDTA)和1～2μL PCR扩增产物,于98℃下变性10 min后,立即冰浴10 min。将变性后的PCR产物用 120 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE 30%,Acr∶Bis=29∶1)电泳,在110 V下预电泳30 min,在120 V下电泳14～16 h,用硝酸银显色后,判别基因型并扫描保存。

1.2.6 PCR产物的回收和测序 用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收PCR产物后,连接到pMD19-T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞中。菌液经PCR检测后,用质粒提取试剂盒提取质粒,交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.2.7 序列分析及数据统计 利用DNAStar软件对测序结果进行拼接,用NCBI网站上的Blast和Blastx程序对克隆获得的序列进行比对。用Expasy网站提供的ProtParam程序预测由cDNA序列推导出的蛋白质的分子量、等电点等理化性质;用Sosui程序预测该蛋白的跨膜结构。运用Clustal W软件对不同物种CYP51基因的氨基酸序列进行在线比对,并运用Mega 4软件构建系统进化树。

采用遗传信息多样性分析软件PopGen32和多态信息含量软件PIC-Calc 0.6计算群体遗传多样性指标。采用SPSS 17.0软件,运用最小二乘法拟合线性模型分析CYP51基因部分外显子不同基因型个体与海胆生长性状之间的相关性,以P＜0.05为差异显著。模型为[9]

Yij=μ+Gi+Eij,

其中:Yij为生长性状观测值;μ为生长观测值的均值;Gi为基因型效应;Eij为随机误差效应。

2 结果

2.1 虾夷马粪海胆性腺总RNA的提取和质量鉴定

虾夷马粪海胆性腺总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。从图1清晰可见28S、18S和5S 3条RNA条带,其中28S RNA条带和18S RNA条带的亮度和宽度比值接近2∶1,5SRNA条带相对比较淡,其A260nm/A280nm值为1.93,说明虾夷马粪海胆性腺总RNA的提取比较完整,可用于下一步试验。

图1 虾夷马粪海胆性腺总RNA的电泳图谱Fig.1 The electrophoretogram of gonad RNA inStrongylocentrotus intermedius

2.2 用RT-PCR法克隆虾夷马粪海胆CYP51基因的cDNA及序列分析

以虾夷马粪海胆性腺总RNA为模板,用随机引物反转录出虾夷马粪海胆cDNA第一链。然后,以上述 cDNA第一链为模板,用引物 HF/HR、MF/MR和LF/LR进行PCR扩增。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果与预期一致,分别在570、656、375 bp处有清晰的条带,且无非特异性扩增条带(图2)。

图2 引物HF/HR、MF/MR、LF/LR的PCR扩增产物Fig.2 PCR products of HF/HR,MF/MR and LF/LR prim ers

将HF/HR、MF/MR、LF/LR 3对引物的PCR扩增产物的测序结果,除去载体序列并用DNAStar进行拼接后获得了1 536 bp的片段。利用Blast程序对拼接后的序列进行比对,确定该序列为虾夷马粪海胆CYP51基因的 cDNA序列,其中包括了1 491 bp的开放阅读框,共编码496个氨基酸。该序列已经被提交到 GenBank中,注册号为JN207907。

运用ProtParam软件预测虾夷马粪海胆CYP51基因编码蛋白的理化性质,结果显示,其相对分子量为56 191.7,等电点为7.14,是一个跨膜蛋白。该蛋白具有一个跨膜螺旋,氨基端位于胞外,羧基端位于胞内,第15至第37位的氨基酸构成了疏水的跨膜结构。

对虾夷马粪海胆CYP51基因的cDNA序列进行Blastx分析,结果显示,其与人Homosapiens(HSU23942)、鼠Musmusculus(NM_020010)、牛Bostaurus(NP_001020490)、猪Susscrofa(BAI47778)、鸡Gallusgallus(NP_001041542)、非洲蛙Xenopustropicalis(NP_001016194)、非洲爪蛙Xenopuslaevis(NP_001087776)、斑马鱼Daniorerio(AAR89625)等脊椎动物的相似性分别为67%、66%、69%、69%、74%、70%、70%、69%,而与紫球海胆 (AY496941)的相似性高达99%。用Mega 4软件对上述9种动物CYP51基因的氨基酸序列与本研究克隆的虾夷马粪海胆CYP51基因的氨基酸序列 (JN207907)构建系统进化树,结果见图3。从图3可见,两种海胆与其它脊椎动物分离而归属于一个进化枝。从比对结果和进化树分析结果可知,海胆的CYP51基因具有种属特异性,而且在进化过程中高度保守。

图3CYP51基因的氨基酸序列系统发生树Fig.3 Phylogenetic tree of am ino acid sequences in CYP51 gene

2.3 虾夷马粪海胆CYP51基因部分外显子的PCR-SCCP分析

用虾夷马粪海胆基因组DNA为模板,用表2所示的7对引物进行PCR-SSCP分析,7对引物全部获得清晰且与预期一致的PCR产物。图4为引物F2/R2的PCR产物,对该PCR产物进行SSCP分析 (图5),结果出现3种基因型:野生型基因型AA和有突变的基因型BB、AB。

图4 引物F2/R2的PCR产物Fig.4 PCR products of prim er F2/R2

图5 引物F2/R2对PCR产物的SSCP分析Fig.5 SSCP analysis of PCR product of primer F2/R2

2.4 虾夷马粪海胆CYP51基因部分外显子的序列及SNPs分析

根据PCR-SSCP分析结果,分别选择AA、BB基因型个体 (各3个个体)的PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。用Mega 4软件对测序结果进行比较后,发现虾夷马粪海胆CYP51基因 (JN207907)开放阅读框的第161个核苷酸发生了A→G的SNP突变。该单核苷酸突变位点位于密码子的第二位碱基,导致氨基酸序列第54位氨基酸由组氨酸 (His,H)变为精氨酸(Arg,R)。

2.5 虾夷马粪海胆CYP51基因部分外显子多态位点的遗传分析

对虾夷马粪海胆CYP51基因部分外显子多态位点的遗传分析结果表明:3种不同基因型AA、AB、BB的频率分别为0.5167、0.2778、0.2056,等位基因A和B的频率分别为0.6556、0.3444,该位点的杂合度 (He)、纯合度 (Ho)、多态信息含量 (PIC)和有效等位基因数 (ENA)分别为0.4529、0.5471、0.3496、1.8235。

2.6 虾夷马粪海胆CYP51基因部分外显子多态性与生长性状的关联分析

利用最小二乘法分析虾夷马粪海胆CYP51基因的不同基因型对180个虾夷马粪海胆个体的壳径、壳高、体质量、性腺质量等4个生长性状的影响,结果见表3。从表3可见,不同基因型虾夷马粪海胆的体质量和性腺质量存在显著差异 (P＜0.05)。其中AA基因型个体的性腺质量和体质量均显著高于AB、BB基因型个体 (P＜0.05),但AB、BB基因型个体的性腺质量和体质量之间均无显著差异 (P＞0.05);不同基因型个体的壳高、壳径之间均无显著差异 (P＞0.05)。

表3 对虾夷马粪海胆个体生长性状的最小二乘法分析结果(平均值±S.E.)Tab.3 The least square analysis of grow th traits in the sea urchin(mean±S.E.)

3 讨论

CYP51基因编码的甾醇14α-去甲基酶参与一些生物活性分子的代谢,所以CYP51基因在动植物生长发育过程中的调控作用已成为CYP51基因的研究重点[10-11]。本研究中不仅首次克隆了虾夷马粪海胆CYP51基因的cDNA序列,并对其进行了SNPs分析。据报道,真核生物的CYP51都是相对分子量为55 000左右的跨膜蛋白[12],本研究中得到的虾夷马粪海胆CYP51基因编码蛋白的理化性质预测结果与这一报道一致。根据不同物种CYP51基因的氨基酸序列构建的进化树显示,虾夷马粪海胆和紫球海胆的CYP51同源性较高,与其它脊椎动物分离而归属于一个进化枝。脊椎动物中哺乳动物、鸟类CYP51与海胆CYP51的亲缘关系相对较远,而两栖类、鱼类CYP51与海胆CYP51的亲缘关系相对较近。这一结果与CYP51在整个生物界由低等到高等的进化趋势相符。

氨基酸序列比对结果显示,底物结合区和血红素辅基结合区等保守区域均能在虾夷马粪海胆中找到。与其它细胞色素P450不同,CYP51不仅有高度保守的血红素辅基结合区,其底物结合区也是高度保守的[12]。序列的保守性是和严格的催化活性联系在一起,由此可以推测,虾夷马粪海胆CYP51的催化功能与其它物种的CYP51基本上是相同的。在哺乳动物体内,14α-去甲基酶 (CYP51)的直接产物是从羊毛甾醇上移去14α-甲基而生成FFMAS。FF-MAS不仅是胆固醇合成过程中的中间产物,而且FF-MAS和以它为底物合成的睾丸促减数分裂甾醇 (testis meiosis-activating sterol,TMAS)都是促减数分裂甾醇。在哺乳动物中,FFMAS和T-MAS存在于卵泡液和睾丸组织中[13],对生殖细胞的形成和成熟过程有重要的调节作用,即在辅助生殖学中扮演着重要角色。体外试验证明,FF-MAS和T-MAS在体外都可以恢复卵母细胞的减数分裂[13-14]。因此,上述两种减数分裂甾醇在生殖调控中的作用越来越受到人们的关注。已有研究显示,小鼠FSH(促卵泡素)诱导的促减数分裂作用需要CYP51基因的激活[15]。而在已经完成减数分裂的精细胞中发现T-MAS[16],预示着T-MAS的功能不只限于促减数分裂的恢复。

PCR-SSCP分析结果显示,虾夷马粪海胆CYP51基因开放阅读框的第161个核苷酸处的单核苷酸多态性 (A→G)与虾夷马粪海胆的性腺质量和体质量之间存在显著相关性 (P＜0.05),即该位点的突变对虾夷马粪海胆的性腺和个体发育的影响显著。虽然,上述单核苷酸突变导致氨基酸序列第54位氨基酸由组氨酸 (His,H)变为精氨酸(Arg,R),但是这种氨基酸的改变是如何影响14α-去甲基酶 (CYP51)功能的具体机理尚不清楚。Byskov等[17]对哺乳动物的研究表明,T-MAS浓度和睾丸质量呈正相关。由此推测,该突变可能影响了虾夷马粪海胆体内MAS的浓度,从而对性腺质量和体质量产生了影响。

生殖细胞的形成、成熟跟它所处的环境即性腺的营养、发育、生长状况等因素都有着密切的联系,生殖细胞的生成和性腺发育分化是互动的过程。从上述突变对性腺质量和体质量产生的影响可知,虾夷马粪海胆的CYP51基因能通过生殖细胞生成过程的调控,对性腺甚至是个体的生长发育起着调节作用。与其它动物相比,虾夷马粪海胆的性腺占海胆个体体质量的百分比 (即性腺指数)较高,一般在10%～20%,因此,CYP51基因对生殖细胞形成、成熟过程的调节以及对性腺质量甚至体质量的影响比对性腺指数较小的动物的影响更为突出。从多方面更深入细致地研究海胆CYP51基因的功能和作用机理,将是下一步研究的重点。

参考文献:

[1] Lepesheva G I,Waterman M R.CYP51-The omnipotent P450[J]. Molecular and Cellular Endocrinology,2004,215(1-2):165-170.

[2] Gibbons G F,Pullinger C R,Mitropoulos K A.Studies on the mechanism of lanosterol 14 alpha—demethylation[J].Biological Chemistry,1979,183(2):309-315.

[3] Trzaskos JM,Fischer R T,Favata M F.Mechanistic studies of lanosterol C-32 demethylation[J].Biological Chemistry,1986,261 (36):16937-16942.

[4] Trzaskos JM,Bowen W D,Shafiee A,et al.Cytochrome P-450-dependent oxidation of lanosterol in cholesterol biosynthesis[J]. Biological Chemistry,1984,259(22):13402-13412.

[5] Yoshida Y,Aoyama Y,Noshiro M,et al.Sterol14 alpha-demethylase P450(CYP51)provides a breakthrough for the discussion on the evolution of cytochrome P450 gene superfamily[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,273(3):799-804.

[6] Berriman M,Ghedin E,Hertz-Fowler C,et al.The genome of the African trypanosomeTrypanosomabrucei[J].Science,2005,309: 416-422.

[7] Lepesheva G I,Waterman M R.Sterol 14α-demethylase Cytochrome P450(CYP51),a P450 in allbiological kingdoms[J].Biochem Biophys Acta,2007,1770(3):467-477.

[8] 仇雪梅,李宁,邓学梅,等.Ex-FABP作为鸡腹脂性状主要候选基因的研究[J].生物化学与生物物理进展,2005,32(5):429-434.

[9] Wang Xiuli,Qiu Xuemei,Meng Xiangying.Preliminary study on polymorphism analysis of SpRunt-1 gene by PCR-SSCP inStrongylocentrotusintermediusand its association with growth traits [J].Mol Bio Rep,2010,37:411-415.

[10] 王凤超.兔促减数分裂甾醇(MAS)合成酶及代谢酶Δ14-SR、CMO的分子全长克隆及表达调控分析[D].北京:中国农业大学,2005:1-98.

[11] Schaller H.The role of sterols in plant growth and development [J].Progress in Lipid Research,2003,42(3):163-175.

[12] 杨娇艳,廖明军,杨劭.甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)的研究进展[J].生物工程学报,2008,24(10):1681-1688.

[13] Byskov AG,Andersen CY,Nordholm L,etal.Chemicalstructure of sterols that activate oocytemeiosis[J].Nature,1995,374:559-562.

[14] Grondahl C,Ottesen JL,lessl M,et al.Meiosis-activating sterol promotes resumption ofmeiosis in oocytes cultured in vitro in contrast to related oxysterols[J].Biology of Reproduction,1998,58: 1297-1302.

[15] 王超.羊毛甾醇14-α去甲基酶(CYP51)基因调节小鼠卵母细胞减数分裂成熟和血浆胆固醇代谢研究[D].北京:中国农业大学,2006:1-135.

[16] Stromstedt M,Waterman M R,Haugen T B,et al.Elevated expression of lanosterol 14α-demethylase(CYP51)and the synthesis of oocytemeiosis-activating sterols in postmeiotic germ cell of male rats[J].Endocrinology,1998,139(5):2314-2321.

[17] Byskov A G,Andersen C Y,Leonardsen A,etal.Meiosis activating sterols(MAS)and fertility in mammals and man[J].J Exp Zool,1999,285:237-242.

Cloning and SNPs analysis of CYP51 gene cDNA in sea urchin Strongylocentrotus intermedius

QIU Xue-mei1,2,WU Ling-zhi2,GUO Xiao-li2,ZHANGWei-jie1,CONG Yu-ting2, CHANG Ya-qing1,2,SONG Jian1,2,LIU Yang2,WANG Xiu-li2
(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023, China;2.College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

In this study,CYP51 gene was cloned and its single nucleotide polymorphisms(SNPs)was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)and polymerase chain reaction single-strand conformation polymorphism(PCR-SSCP)in sea urchinStrongylocentrotusintermedius.The results showed that the 1 536 bp sequence including a 1 491 bp open reading frame(ORF)and encoding 496 amino acidswas obtained fromCYP51 gene.A SNP A→G was found in the 161st nucleotide of open reading frame inCYP51 cDNA.The analysis of the SNPs showed that there was a significant association(P＜0.05)between the SNP and growth traits such as gonad weight and body weight.TheCYP51 cDNA cloning and its SNPs analysiswas the first time conducted in sea urchinStrongylocentrotusintermedius.The findings provide basic theory ofmolecularmarker-assisted breeding of the sea urchin.

Strongylocentrotusintermedius;CYP51 gene;cloning;single nucleotide polymorphism(SNPs)

S917

A

2012-03-27

辽宁省自然科学基金资助项目 (20102043);辽宁省 “百千万人才工程”项目 (2010921093)

仇雪梅 (1964-),女,博士,教授。E-mail:xmqiu@dlou.edu.cn

2095-1388(2012)04-0294-06