恩施窑归中多糖和挥发油含量测定

文德鉴

湖北民族学院医学院(湖北恩施445000)

当归是伞形科植物当归Angelica sinensis(oliv.)Diels的干燥根。具有多种药理学效应，如补血活血、调经止痛、润肠通便功效;用于血虚萎黄，眩晕心悸，月经不调，经闭痛经，虚寒腹痛，肠燥便秘，风湿痹痛，跌扑损伤［1］;增强机体免疫功能，保护肝肾等。素有“十方九归”之称，其主要活性成分为多糖、阿魏酸、挥发油、黄酮类等。窑归为恩施石窑产当归的习称，其质量优良，为南方常用当归品种。为评价窑归的质量并建立质量标准，本实验选取多糖和挥发油为指标，采用可见分光光度法，经3，5－二硝基水杨酸显色测定多糖含量，采用药典挥发油测定法甲法测定窑归中挥发油含量，现报道如下。

1 材料与仪器

1.1 材料

1.1.1 实验药材 当归(由湖北民族学院医学院中药教研室提供，购于湖北恩施石窑)，干燥，粉碎过筛，存放于干燥器中备用。

1.1.2 试剂 无水葡萄糖标准品(中国药品生物制品鉴定所，批号:110833－200904)，3，5—二硝基水杨酸、氢氧化钠、硫酸、酚酞、无水乙醇等均为分析纯。

1.2 仪器 GZX－9030 MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，HH－W600数显恒温水箱(金坛市医疗仪器厂)，TU－1901紫外分光光度仪(北京普析通用仪器有限公司)，BS224S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，TDL—5台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，CQ—250超声波清洗器(上海弘兴超声电子仪器有限公司)，粉碎机等。

2 方法

2.1 DNS试剂的配制 精密称取约6.5 gDNS(3，5－二硝基水杨酸)，加少量蒸馏水溶解，转移至容量瓶(1000 mL)中，加325 mL2 mol/L氢氧化钠溶液，再加入丙三醇45 g，混匀，继续加蒸馏水至1000 mL。

2.2 对照品溶液的配制 精密称定于105℃干燥至恒重的葡萄糖100 mg，加蒸馏水溶解并转移至100 mL的容量瓶中，继续加蒸馏水至100 mL，得标准溶液，备用。

2.3 多糖的提取方法 取当归粉末25 g，石油醚回流提取1.5h，滤过，弃去滤液，滤渣用80%乙醇回流提取1.5 h，滤过，弃去滤液，滤渣用蒸馏水提取3次，每次1.5 h，合并3次滤液，滤液浓缩至100 mL，加95%乙醇使含醇量达80%，低温(4℃左右)放置24 h，即析出粗多糖。用Sevage法［2］对粗多糖进行脱蛋白［2］，直至260 nm和280 nm处无明显光吸收为止，收集上清液，用0.2%活性炭脱色2次，干燥，得当归多糖，称重。

2.4 供试样品溶液的配制 取当归多糖粉末适量，精密称定，加10 mL l mol/L硫酸，水浴加热5 h，冷却，加酚酞指示剂一滴，加2 mol/L氢氧化钠溶液至溶液呈微红色，定量转移至25 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，备用。

2.5 最大吸收波长的选择 分别准确量取标准液和样品液各1.00 mL于25 mL容量瓶中，分别加蒸馏水至溶液体积为2.50 mL，再精密加入DNS试剂3.0 mL，摇匀，沸水浴煮沸5 min，立即冷水浴冷却，加蒸馏水至刻度，混匀。以3 mL蒸馏水作随行对照。在400～600 nm范围内进行扫描，样品和对照品在499 nm处均有最大吸收，故确定测定波长为499 nm。

2.6 挥发油含量测定方法 按照中国药典附录XD挥发油测定法甲法进行测定［1］。

3 结果

3.1 线性关系考察 分别精密量取0.00、0.20、0.40、0.80、1.60、2.50mL 葡萄糖对照品溶液于 25 mL容量瓶中，分别加蒸馏水至溶液体积为2.50mL，再精密加入DNS试剂3.00mL，摇匀，水浴煮沸5min，立即冷水浴冷却，加蒸馏水至刻度，混匀。以空白试剂为对照，在499 nm处测定吸光度，得回归方程:A=0.2391C－0.02486，r=0.9992。表明葡萄糖在0～0.10 mg/ml与吸光度呈良好的线性关系。

3.2 精密度试验 取同一多糖供试品溶液3 ml，在499 nm处测定吸光度，连续测量5次，结果RSD为2.3%，提示精密度良好。

3.3 重现性试验 取同一批次窑归5份，按多糖的提取及供试品溶液制备和含量测定方法操作，在499 nm处测定吸光度，计算其多糖含量，RSD为2.2%，表明本法重现性良好。

3.4 加样回收试验 精密称取已知含量的窑归样品粉末1.3124 g于锥形瓶中，加入当归多糖35.4 mg，按多糖的提取及供试品溶液制备和含量测定方法操作，测定吸光度，计算回收率。平均加样回收率为 98.69%，RSD 为 2.7%(n=5)。

3.5 稳定性试验 精密吸取多糖供试品溶液0.2 ml，分别在 0、30、60、90、120 min 测定。结果，多糖供试溶液测得质量分数的 RSD为2.33%(n=5)，表明多糖供试品溶液在120 min内稳定。

3.6 样品液中多糖含量测定 精密称定不同批次的窑归药材粉末，按多糖的提取及供试品溶液制备和含量测定方法操作，在499 nm处测定吸光度，据标准工作曲线计算样品中多糖的含量。结果见表1。

表1 不同批次窑归中多糖的含量(n=5)

3.7 窑归中挥发油含量测定 结果见表2。

表2 窑归中挥发油的含量(n=5)

4 讨论

多糖广泛存在于自然界，是多种中草药的有效成分之一，具有多种生物活性，是理想的免疫增强剂，它能提高机体免疫系统的功能，不仅能促进T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞的功能，还能促进白介素、干扰素、肿瘤坏死因子等细胞因子的产生［3］。目前已有多种多糖物质被发现，其作用机制以及生物功能与结构的关系的研究不断深入。当归的水提取物中有多种具有抗补体活性的多糖，并具有多种免疫药理活性，对造血系统有明显作用，对抗肿瘤、抗辐射损伤也显示较好的疗效［3，4］。因此，将多糖含量列为窑归的质量评价与控制指标之一。

窑归中多糖的含量为25.73%，明显高于文献［5］报道的含量，以当归多糖来评价，窑归的质量明显优于文献报道的当归质量。多糖的平均含量为25.73%，样品中多糖的最低含量为24.34%，因此将窑归中多糖的含量标准定为不低于20%。本实验方法操作简便、快速、准确，重现性好，可作为窑归多糖含量的测定方法。

当归挥发油主要含有(Z)－藁本内酯、6－正丁基环庚二烯、1－甲基－1－茚满醇、氧化石竹烯、棕榈酸、邻苯二甲酸和香荆芥酚等多种化学成分，对正常离体大鼠子宫平滑肌的收缩功能呈双向调节作用，可治疗痛经，保护局灶性脑缺血，改善心肌缺血，抗心律失常，平喘，提高机体免疫功能及抗炎镇痛等［6，7］。因此，将挥发油含量也列为窑归的质量评价与控制指标之一。

［1］国家药典委员会.中国药典(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:124－125;附录63.

［2］苗明三，李振国.现代实用中药质量控制技术［M］.北京:人民卫生出版社，2007:56.

［3］温悦，傅正毅，赖艳.当归多糖的药理作用研究进展［J］.中国医药导报，2012，9(30):27－29.

［4］张翠兰，文德鉴.当归对血液及造血系统药理作用研究进展［J］.湖北民族学院学报(医学版)，2002，19(4):34－35.

［5］何先元，许晋芳，王秋霜，等.当归多糖的超声提取及含量测定［J］.中国药业，2010，19(19):34－35.

［6］杜俊蓉，白波，余彦，等.当归挥发油研究新进展［J］.中国中药杂志，2005，30(18):1400－1406.

［7］倪竹南，吕圭源，楼招欢，等.当归挥发油化学成份和药理作用研究进展［J］.中国中医药信息杂志，2007，14(7):93－95.