双模态标记F344大鼠骨髓间充质干细胞移植入大鼠心脏后离体及在体影像示踪

曹 剑，王怡宁，石新琳，马国涛，孔令燕，薛华丹，雷 晶，何泳蓝，金征宇

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1放射科 2心外科，北京 100730

近年来，通过干细胞移植治疗急性心肌梗死的研究已经取得了较大进展，文献报道在宏观上能够观察到干细胞治疗后心室功能的恢复，但对于移植干细胞的分布分化等生物学过程尚缺乏深入了解［1-3］。分子影像学技术可以实现对移植细胞的动态、无创、高效和长期示踪，特别是多模态成像的方法，将不同的技术有机结合起来以取长补短，是研究移植干细胞生物学过程的关键［4］。本研究以超小超顺磁性纳米氧化铁颗粒 (ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)标记表达红色荧光蛋白的F344大鼠骨髓间充质干细胞，选择磁共振和光学两种成像模式，以期发挥磁共振成像组织分辨率高及光学成像敏感性和信噪比高的优势，对在体双模成像的可行性进行初步探索。

材料和方法

实验动物 健康F344大鼠10只，购自北京维通利华动物技术有限公司，体重250～300 g，性别不限，饲养于中国医学科学院基础医学研究所普通级动物房，所有动物实验均按照中国医学科学院动物管理条例执行。本研究获得北京协和医院实验动物伦理委员会同意。

材料 表达红色荧光蛋白 (red fluorescence protein，RFP)的F344大鼠骨髓间充质干细胞 (bone mesenchymal stem cells，BMSCs)及完全培养基 ［赛业 (广州)生物科技有限公司］，USPIO(Bayer Schering Pharma AG公司惠赠，德国)，0.01%多聚赖氨酸 (Sigma，美国)，MTS(Promega，美国)。1.5 T超导型磁共振扫描仪 (Signal Excite HD，GE，美国)，ALC-V8D小动物呼吸机 (北京吉安得尔科技有限公司)，PIXIS 1024BR CCD光学成像系统(中国科学院自动化研究所)。

USPIO标记F344大鼠BMSCs 配制浓度为USPIO 40μg Fe/ml、多聚赖氨酸 1.5μg/ml的含铁培养基，其中多聚赖氨酸作为转染剂，将状态良好的BMSCs在37℃、5%CO2条件下培养孵育过夜(24h)，构建USPIO-RFP双标BMSCs。

USPIO标记的有效性及安全性检测

普鲁士蓝染色:4%多聚甲醛固定双标干细胞，加入等体积混合的2%亚铁氰化钾溶液和2%盐酸溶液，显微镜下观察，计算标记阳性率;计数3次取平均值。

电镜检查:(1)USPIO标记干细胞;(2)细胞固定 (戊二醛、四氧化锇);(3)丙酮梯度脱水;(4)浸透;(5)包埋;(6)修块;(7)制备50～60 nm超薄切片，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，水洗晾干备用;(8)透射电镜观察并照相。

台盼蓝拒染实验:0.05%胰酶消化细胞成单细胞悬液;取20 μl悬液滴入细胞计数板，随后加入2滴2%台盼蓝溶液，显微镜随机视野下计数100个总细胞，计数活细胞数 (正常活细胞不被染色，而死细胞被染成蓝色);计数3次取平均值，并比较标记组细胞和阴性对照组活力。

建立F344大鼠心肌梗死模型及心肌注射双标BMSCs 实验组 (n=8)于腹腔麻醉成功后行气管穿刺插管，小动物呼吸机辅助通气条件下，开胸以6-0聚丙烯缝线结扎冠脉左前降支，术中监测心电图，以出现ST段抬高作为心肌梗死成功标志。建模成功后约10 min，直视下使用微量注射器于梗死心肌周边注射双标BMSCs(数量2.0×106，体积150 μl)，逐层缝合关胸，观察15 min后拔管脱机。对照组(n=2)不做任何处理。

心脏磁共振成像示踪标记BMSCs 实验组及对照组均行心脏磁共振成像，实验组分别于双标干细胞移植后1 d、1周、2周及4周时进行磁共振扫描;对照组扫描1次即可。大鼠于磁共振检查前行腹腔麻醉，胸部备皮，粘贴磁共振兼容电极片以实现心电门控。扫描采用3英寸线圈，选择快速扰相位梯度回波序列进行短轴二腔心平面扫描，具体参数:重复时间7.6 ms，回波时间3.5 ms，视野大小13 mm×13 mm，层厚/层间距2.0/0 mm，矩阵160×160，激励次数4。选取实验组磁共振图像信号减低最明显的层面，于工作站测量并比较注射细胞区域信号强度 (signal intensity，SI)变化率:ΔSI=|SIL-SIM|/SIM×100%，其中SIL及SIM分别为信号减低区域和正常心肌的信号强度，各部位所选感兴趣区大小尽量保持一致(1～2 mm2)。

在体光学成像 磁共振成像结束后24 h内，将F344大鼠经腹腔麻醉，仰卧位充分暴露心脏区域，置于PIXIS 1024BR CCD光学成像系统中进行成像(绿色荧光激发)。

离体光学成像 术后第4周在体光学成像结束后将F344大鼠麻醉处死，仰卧固定于操作台分离取出心脏，生理盐水冲洗后将心脏置于光学成像设备中，暗室条件下激发光成像，成像完成后将心脏浸泡在福尔马林溶液中固定。

病理组织学检查 心脏经福尔马林溶液浸泡固定，根据术中缝线位置切取梗死区心肌，脱水、包埋后行石蜡切片，进行HE染色观察心肌结构、普鲁士蓝铁染色检查USPIO位置、荧光成像观察干细胞分布。

统计学处理 使用SPSS 17.0统计学软件，采用t检验对标记组和阴性对照组进行细胞活力比较，不同时间点心肌MRI信号强度变化率 (ΔSI)的比较采用单因素方差分析;P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

USPIO标记BMSCs有效性及安全性检测

普鲁士蓝染色:显微镜下可见细胞内有大量蓝染颗粒，部分聚集成团，颗粒分布以核周和靠近细胞膜处较为明显;偶见标记阴性的细胞。细胞平均染色率为99%。

电镜检查:透射电镜观察标记细胞，可见核膜完整、核仁清晰，胞质内内质网丰富、可见黑色颗粒USPIO多位于各级溶酶体内。

台盼蓝拒染实验:于显微镜下可见死细胞被均匀染成蓝色，标记组和阴性对照组活细胞率差异无统计学意义 (95.7% 比96.3%，P＞0.05)。

在体磁共振成像 实验组8只F344大鼠心脏磁共振成像显示左右心室结构清晰，在左心室前壁可见信号减低区 (图1)，不同时间点 (1 d、1周、2周和4周)该区域心脏信号减低区的信号强度变化率 (ΔSI)分别为 71.77±5.32、69.60±3.16、68.90±6.56和68.00±5.76，差异无统计学意义(P=0.66)。对照组2只F344大鼠心脏磁共振成像显示左右心室结构清晰，心脏收缩运动协调，心肌信号均匀，未见明显信号减低或增高区域。

在体及离体光学成像 F344大鼠 (实验组和对照组)在体荧光成像未检测到心脏区域有荧光信号，鼠皮毛产生较高的背景荧光干扰。将心脏取出后，置于与在体荧光成像同样的激发光和发射光条件下进行光学成像，实验组大鼠心脏在干细胞注射部位可以观察到微弱的荧光 (图2)。

病理组织学检查结果

HE染色:正常心肌组织结构完整;局部心肌HE染色显示细胞轮廓虽然存在，但是细胞核消失，符合心肌梗死病理表现，其周围可见细胞核密度明显增加，考虑为移植干细胞。

普鲁士蓝染色:HE染色中考虑为干细胞聚集区域的部位存在大量蓝染颗粒沉积，其余心肌组织内未见明显蓝染颗粒分布 (图3)。

图1 细胞移植后不同时间大鼠心脏磁共振成像结果 (快速扰相梯度回波序列，短轴两腔心图像)Fig 1 Magnetic resonance imaging results of rat heart over time after cellular transplantation(fast spoiled gradient echo sequence，shortaxis image)

图2 离体心脏荧光成像Fig 2 In vitro fluorescence imaging of rat heart

荧光成像:普鲁士蓝染色蓝染颗粒分布区域可见红色荧光蛋白聚集，其余心肌组织内未见明显红色荧光蛋白分布 (图3)。

讨 论

本研究将磁共振-光学双标的BMSCs干细胞注射至急性心肌梗死F344大鼠的梗死心肌周围，并对其进行在体和离体的磁共振成像、光学成像，结果显示磁共振可以实现对移植干细胞进行在体成像示踪，而光学成像在体成像结果阴性，离体成像于细胞注射部位可以获得一定程度的荧光成像。

国内外文献中，有关大鼠心脏MRI的研究多在小动物专用磁共振成像设备上进行，磁场强度达4.7T、7T甚至更高，配合小动物专用的心电、呼吸门控设备，可以获得质量很高的大鼠或小鼠的心脏磁共振图像［5］。本研究参照文献 ［6］，利用临床型1.5T磁共振设备进行F344大鼠心脏磁共振成像，经过初步实验，本研究基本掌握了大鼠心脏磁共振成像的技术，为今后进一步深入研究打下基础。

图3 4周时大鼠心脏普鲁士蓝染色 (×200)(A)和荧光成像 (×400)(B)Fig 3 Prussian-blue staining(×200)(A)and fluorescence imaging(×400)(B)of the rat heart on week 4

本研究通过计算SI变化率观察双标BMSCs移植后心肌信号强度随时间的变化，发现随着时间的延长 (4周内)，SI并未发生统计学变化。文献报道USPIO/SPIO标记的干细胞凋亡后残留的铁颗粒会留下伪影［7］。另外，Zhang等［8］的研究指出巨噬细胞中存在一定量残留的SPIO颗粒并停留在心肌部位。这些残留的铁颗粒成为一个假阳性信号，对利用MRI长期在体示踪干细胞带来一定的干扰。本研究选用USPIO-RFP双标干细胞，是为了克服磁共振成像假阳性的缺陷，相互印证，提高干细胞移植后在体监测的准确性。

以在体光学成像为基础的小动物实验研究已有不少，但这些研究所利用的小动物模型多为小鼠或裸鼠，涉及大鼠的也多是皮下在体成像，其中结合MRI技术进行的双模态成像相对更少［9］。本研究采用大鼠模型进行心脏在体光学成像，经验少、难度大，虽然最终未能获得理想的在体荧光图像，但是仍然有不少收获。根据本研究体外对标记细胞的荧光强度检测结果及光信号的衰减规律，如果注入体内的荧光基团距体表深度为1cm，要达成近似体外成像的效果，注入的细胞数至少要达到107，然而实际显示，此浓度的细胞液几乎无法制成单细胞悬液，无法通过注射移植。组织深度对光学信号的影响很大，并且激发荧光成像的方法存在两次衰减，对荧光基团的信号强度要求较高。因此，笔者认为可从以下方面对实验进行进一步改进:(1)提高光学标记细胞的效率或选择荧光强度更强的荧光基团:提高内源性试剂如RFP在细胞中的表达效率可以获得更强的荧光信号，另外，新型的RFP正在不断地被筛选出来，如mCherry，Katushka等红色荧光蛋白被报道有着更强的荧光强度和更接近于近红外光波段的发射光波长［10］，对于在体荧光成像相对于普通的RFP有着更大的优势;(2)可以尝试用萤火虫荧光素酶的在体生物发光成像:以萤火虫荧光素酶为光学信号标记干细胞进行在体示踪的文献报道虽然多以小鼠模型为基础［8，11］，但从理论上，在体生物发光只需要经过一次组织的衰减作用，与荧光成像相比有一定优势。

本研究是对双模态成像在体示踪干细胞的初步探索，尚存在一定的不足。首先，动物数量少，分组情况有待进一步细化;其次，随访观察时间尚较短，未能对USPIO标记的远期示踪效果进行评估;再次，缺少对干细胞治疗效果的短期和长期研究，在接下来的研究中可以通过测定心功能的变化，对病理切片进行定量分析，评估干细胞治疗的效果和分化情况。

综上，USPIO-RFP双标F344大鼠骨髓间充质干细胞注射急性梗死心肌周围后，磁共振成像可以实现对双标干细胞的在体示踪，离体光学成像和病理分析亦可以实现对双标干细胞的示踪，而在体光学成像示踪双标干细胞有待进一步探索。

［1］Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al.Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium ［J］.Nature，2001，410(6829):701-705.

［2］Aassmus B，Rolf A，Erbs S，et al.Clinical outcome 2 years after intracornoary administration of bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction ［J］.Circ Heart Fail，2010，3(1):89-96.

［3］Schoenhard JA，Hatzopoulos AK.Stem cell therapy:pieces of the puzzle ［J］.J Cardiovasc Transl Res，2010，3(1):49-60.

［4］Lau JF，Anderson SA，Adler E.Imaging approaches for the study of cell-based cardiac therapies ［J］.Nat Rev Cardiol，2010，7(2):97-105.

［5］Driehuys B，Nouls J，Badea A，et al.Small animal imaging with magnetic resonance microscopy ［J］.ILAR J，2008，49(1):35-53.

［6］Young JK，Yong MH，Kyu OC，et al.In vivo magnetic resonance imaging of injected mesenchymal stem cells in rat myocardial infarction;simultaneous cell tracking and left ventricular function measurement［J］.Int J Cardiovasc Imaging，2009，25(Suppl 1):99-109.

［7］Chen IY，Greve JM，Gheysens O，et al.Comparison of optical bioluminescence reporter gene and superparamagnetic iron oxide MR contrast agent as cell markers for noninvasive imaging of cardiac cell transplantation ［J］.Mol Imaging Biol，2009，11(3):178-187.

［8］Zhang H，Qiao H，Bakken A，et al.Utility of dual-modality bioluminescence and MRI in monitoring stem cell survival and impact on post myocardial infarct remodeling［J］.Acad Radiol，2011，18(1):3-12.

［9］Chen K，Yap LP，Park R，et al.A Cy5.5-labeled phagedisplayed peptide probe for near-infrared fluorescence imaging of tumor vasculature in living mice ［J］.Amino Acids，2012，42(4):1329-1337.

［10］Deliolanis NC，Kasmieh R，Wurdinger T，et al.Performance of the red-shifted fluorescent proteins in deep-tissue molecular imaging applications ［J］.J Biomed Opt，2008，13(4):44008.

［11］Bai X，Yan Y，Coleman M，et al.Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging ［J］.Mol Imaging Biol，2010，13(4):633-645.