犬精液冷冻液的优化试验

沈留红，杨庆稳，何 桥

（四川农业大学动物医学院，四川 雅安 625014）

1969年Seager（美国）使用冷冻精液成功以来，犬冷冻精液即成为犬繁殖生理学研究的一部分。发达国家犬的冷冻精液研究与推广起步早，发展快。但在我国养犬业中冷冻精液的研究和应用还不广泛，这不仅制约了中国犬良种化的进程，同时也增加了成本。目前，犬冷冻精液解冻后的活率仅在0.4左右，精子复苏率、活力和存活时间也相对较低［1］。笔者通过对不同配方的稀释液、添加不同剂量的不同维生素对解冻后精子活力影响的试验，试图找到一种优良稀释液，达到提高冷冻精液精子活率的目的，为进一步在生产当中提高冷冻精液的品质提供一定参考。

1 试验材料

1.1 试验动物 昆明系狼犬5只，体重20～30kg，年龄2～8岁，健康，体况良好。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试验试剂 三羟甲基-氨基甲烷（Tris）、双轻乙基-氨基乙烷磺酸（BES）、葡萄糖、乳糖、果糖、柠檬酸、甘油、青霉素、链霉素、卵黄、姬姆萨染液、伊红-苯胺黑死活染色液、维生素B12、维生素C、复合维生素B等。

1.2.2 试验仪器 电光生物显微镜、细胞计数器、恒温箱、离心机、液氮罐、pH值试纸等。

1.3 试验地点 四川农业大学兽医产科和胚胎工程基地实验室。

1.4 试验动物处理 试验前2周进行犬瘟热、细小病毒疫苗免疫，适应性单笼饲养，主要以玉米、鱼粉、豆粕、谷皮等为主要原料的配合饲料附以少量生肉及牛杂等定时、定量、由固定饲养员常规饲喂，自由饮水，采精后每只犬补食两枚生鸡蛋。

2 试验方法

2.1 精液的采集 用拇指和食指握住犬阴茎，轻拉包皮，将龟头球握在手掌内并给予适当压力，待阴茎充分勃起，用集精漏斗收集精液。

2.2 精液品质的常规检查

2.2.1 精液的气味与色泽的检查 无异味、乳白色或淡乳白色者为正常精液；否则均为不正常。

2.2.2 精液的pH值检查 取一小滴精液用pH值为5.0～8.4的精密试纸测定。

2.2.3 精子活力的检查 将精液置于37℃的显微镜下，放大400～600倍镜检，用10级评分法作初步评分。进一步用伊红-苯胺黑死活染色法检测（活精子不着色）。

精子活率＝呈直线运动精子数／总精子数×100%

2.2.4 精子密度的测定（血细胞计数法） 血细胞计数法［2］，在400倍显微镜下目测活力，将精液用生理盐水20倍稀释后用血细胞计数板计算密度。

2.2.5 顶体完整率 用姬姆萨染色法［3］，滴压制片，在1000倍显微镜下检测（活精子不着色）。

精子顶体完整率＝顶体完整型精子数／精子总数×100%

2.2.6 精子畸形率的检查 用姬姆萨染色法［3］，每样品做两个涂片。在每片左右二个不同部位各数100个精子，用血细胞计数器记录下每个部位的畸形精子数；每样品两个涂片的平均畸形精子数，代表此精液样品的畸形精子数。

畸形率＝（片1左右部畸形总数＋片2左右部畸形总数）／400×100%

2.3 精液的稀释 根据原精子的活力、密度等因素采用一步稀释法对精液进行稀释。稀释前，先将稀释液预热到38℃左右。试验中一般将精液密度保持在1.0×108／mL左右，不应过高，这样有利于解冻后精子活力的检测。稀释液现配现用，配好后摇匀，1000r／min离心20min。

在大量预备试验的基础上，筛选出效果较好的稀释液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其配方见表1。

表1 稀释液配方

2.4 精液的降温与平衡 把稀释好的精液包上8～16层纱布，转移到4℃的恒温环境中。

2.5 犬颗粒冻精制作 用泡沫塑料改制成炸熏盒，内设两室：一室内上置铜纱网，下盛液氮，并设一盖子，为“熏室”；另一室内可直接盛放液氮，为“炸室”。将平衡后的精液直接滴于炸室内液氮中，滴后静置5～8s，在移入熏室中加盖熏蒸6min，收集装袋，浸入液氮。

2.6 精液的解冻 将试管预热到35℃～40℃，从液氮罐内取出颗粒精液迅速投入试管内，轻轻摇动，待颗粒融化到2／3时，即从水浴中取出，继续摇动使其全部融化。

3 试验结果

3.1 不同稀释液类型对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响 见表2。表2所示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种稀释液制作的冻精解冻后活率均大于30.00%，Ⅰ液的冻后平均活率最高，但Ⅰ液和Ⅱ液差异不显著（P＞0.05），都与Ⅲ液差异显著（P＜0.05）；顶体完整率和畸形率Ⅰ液优于Ⅱ、Ⅲ液，差异显著（P＜0.05），Ⅱ液与Ⅲ液之间差异不显著（P＞0.05）。

表2 不同稀释液类型对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响

3.2 添加不同剂量的维生素B12对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响 选用组方Ⅰ添加不同剂量的维生素B12作为冷冻液，表3可知，随着维生素B12量的增加，解冻后精子活率、精子顶体完整率变化不大，差异均不显著（P＞0.05），畸形率以12 mL组和16mL组较低，与其他组差异显著（P＜0.05）。3.3 添加不同剂量的复合维生素B对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响 复合维生素B（每2mL含维生素B120mg，维生素B22mg，维生素B62 mg，烟酰胺30 mg）的添加如表4可知，4 mL／100mL组的活率平均高于其他组，与对照组和6mL／100mL、8mL／100mL差异显著（P＜0.05），顶体完整率与精子活率的结果相似，而精子畸形率以8mL／100mL组最高，与其他组差异显著（P＜0.05），4 mL／100 mL、2 mL／100 mL 组 最 低 在23.58%～24.15%范围内，与其他组差异显著（P＜0.05）。

表3 添加不同剂量的维生素B12对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响

表4 添加不同剂量的复合维生素B对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响

3.4 添加不同剂量的维生素C对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响 不同维生素C（0.25 g／2mL）浓度量添加精子平均活率4mL／100mL组高于其他组（见表5）与8mL／100mL差异显著（P＜0.05），同其他添加组及对照组差异不显著（P＞0.05）。顶体完整率以4mL／100 mL、6 mL／100mL组最高，分别为74.58%±1.59%、74.39%±1.78%，两组间差异不显著（P＞0.05），二者均与其他组差异显著（P＜0.05）。精子畸形率以对照组最高31.81%±2.30%，加入维生素C后，畸形率有所降低，其中6mL／100 mL组最低为25.57%±2.49%，与对照组差异显著（P＜0.05）。

表5 添加不同剂量的维生素C对解冻后精子顶体完整率、活率和畸形率的影响

4 分析与讨论

4.1 选择不同的冷冻稀释液对于犬冷冻精液的品质起着十分关键的作用［4］，试验证明，筛选出的3种稀释液均能较好的保持精子的活力，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组稀释液制作的冷冻精液解冻后的活率均大于30.00%，稀释液Ⅰ组的活率为最高达到了43.35%±0.85%，3者均达到了可用于AI冻精的最低标准，对精子复苏后各项指标进行分析，说明这3种配方均能在犬精液冷冻生产中使用。这3种稀释液中的Tris和柠檬酸钠的作用机理是调节精液的pH值，使精子的存活时间延长［5］。对精子的保护作用较为明显。而Ⅰ、Ⅱ组之间的精子活力无显著差异（P＞0.05），说明这两种稀释液对犬精子的保护效果基本相同。其中葡萄糖、果糖、卵黄等提供营养，以补充精子所消耗的能量。一些分子能渗透精子膜到细胞内，参与精子代谢，给精子提供外源性能量，减缓内源性物质的消耗，从而延长精子在外界的存活时间［6］。在前人研究的基础上，本试验均加入了甘油作为超低温保存防低温打击物质，卵黄和糖类在一定程度上也起到了这种作用。由于精液和稀释液都是营养丰富的物质，是细菌等微生物孪生的适宜环境，它们的存在与繁殖在精液保存过程中可能直接影响到精子活率，所以抗生素的添加必不可少，一般常常加入青霉素和链霉素，可以达到有效的抗阴性菌和阳性菌的作用。

4.2 通过3种维生素的添加发现，明显提高冻精解冻后的精液品质，利于精液冷冻保存［7］。精子呼吸代谢产生的活性氧族，可氧化精子细胞质膜上的不饱和脂肪酸，使质膜发生不可逆的氧化损伤，丧失流动性，使细胞内酶缺失，引起DNA损伤。维生素B12作为辅酶能使氧化型（-S-S-型）谷胱甘肽还原成还原型（-SH-型），-SH-型的谷胱甘肽能还原活性氧族，减少精子质膜的氧化损伤，保护精子质膜的完整性［8］；从试验结果可以看出，解冻后精子活率平均值都高于对照组，但差异均不显著（P＞0.05），而且随着维生素B12量的增加，活率变化不大。试验结果表明，添加复合维生素B的量为4mL／100mL较理想，但其活率与对照组差异不显著（P＞0.05），顶体完整率最高，精子畸形率最低，与对照组差异显著（P＜0.05）。但添加复合维生素B后能提高犬精液冻后精子活率的理论依据并不清楚，其复杂性和不稳定性还有待于进一步的研究；维生素C一方面作为抗氧化剂清除细胞呼吸而产生的活性氧离子，从而保护精子不受由于冷冻而产生的自由基毒害；另一方面维生素C可促进包括细胞内维生素E在内的一些其他抗氧化剂物质生成［8］。本试验结果得出，4mL／100mL的维生素C精子活率最高，但与对照组差异不显著（P＞0.05），顶体完整率最高，精子畸形率低，与对照组差异显著（P＜0.05），说明适量添加维生素C能保护精子顶体，降低畸形率；而过量添加（8mL／100mL）时，品质会降低，可能是因为维生素C是酸性抗氧化剂，过量添加会使稀释液pH值降低、渗透压增大，使精子的顶体和质膜受到损伤。

5 结语

5.1 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种稀释液制作的冻精解冻后活率均大于30.00%，Ⅰ液的冻后平均活率最高，但Ⅰ液和Ⅱ液，差异不显著（P＞0.05），Ⅲ液最低，差异显著（P＜0.05）；顶体完整率和畸形率Ⅰ液均优于Ⅱ、Ⅲ液，差异显著（P＜0.05），Ⅱ液与Ⅲ液之间差异不显著（P＞0.05）。Ⅰ号稀释液为本试验中最佳稀释液，其冷冻精液解冻后活率可达43.35%±0.85%。

5.2 在稀释液中添加维生素B12，对解冻后精子的活率、精子顶体完整率变化不大，但平均值都高于对照组，并且随着维生素B12量的增加，精子畸形率有继续降低趋势。

5.3 添加复合维生素B、维生素C对昆明系狼犬精子均有较好的保护作用，但其添加量并非越多越好，以复合维生素B 4mL／100mL、维生素C 4mL／100 mL添加为宜。

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