猪巨细胞病毒gB基因的克隆与序列分析

刘兴彩，尹燕博，徐守振，李吉达，张 毅，郭妍妍

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109；2.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193；3.青岛澳兰百特生物工程有限公司，山东 青岛 266101）

猪巨细胞病毒（porcine cytomegalovirus，PCMV）属于疱疹病毒科，β疱疹病毒亚科、巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）属的成员；近来有人认为将本病毒划在玫瑰疹病毒属中更为恰当［1］。其gB蛋白是CMV重要跨膜糖蛋白，在病毒与机体细胞膜的粘附、融合及病毒进入细胞和在细胞间的转移起作用［2］；gB蛋白具有较好的免疫原性［3］，可诱导机体产生抗CMV的特异性免疫应答［4-5］。我们应用PCR诊断方法对全国11个省市地区猪场的100份临床样品进行了检测［6］，筛选出4份PCR阳性病料，进行了gB基因的克隆与序列分析，为PCMV的分类地位和进化关系提供更多的信息。

1 材料与方法

1.1 病料 来自郑州、福建、浙江金华和宁波病猪的肺脏。

1.2 菌株和载体 感受态细胞DH5α和pMD 18-T载体。

1.3 主要仪器和试剂 PCR扩增仪（LongGene MG96G），琼脂糖（美国Promega公司），Taq DNA聚合酶（5U／μL）、dNTPs（25μmol／L）为宝生物工程（大连）有限公司产品，其他化学试剂均为国产分析纯级。

1.4 引物 根据GenBank发表的PCMV AF268041序列，应用Primer Premier 5.0设计了PCMV gB全基因引物 g1：5′-ATGACAGTGAGCAGTCGGAA-3′；g2：5′-TCACACGTCCTCGGTGGATAG-3′，并由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.5 DNA的提取 按照文献［6］中的提取方法进行提取。

1.6 gB基因PCR扩增 取出已分装有PCR反应体系的离心管，加入2μL上述模板，混匀后稍离心，置PCR 仪中扩增：95℃ 5 min，94℃ 30s，62℃30s，72℃2min，30个循环，72℃ 10min.取 PCR产物5μL在10g／L琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察结果。

1.7 阳性克隆的鉴定与测序 回收PCR产物大小为2580bp，按照连接试剂盒说明书进行连接，然后将连接产物转化到感受态细胞DH5α中，涂平板蓝白斑筛选，将白色菌落接种到LB液体培养基中，置37℃剧烈震荡培养12h后，进行PCR鉴定，将阳性菌株送宝生物工程（大连）有限公司测序。

1.8 序列分析 应用DNAStar软件将测序结果与其他PCMV核苷酸和推测的氨基酸序列进行同源性分析，与疱疹病毒各亚科gB糖蛋白进行氨基酸序列分析，并与人疱疹病毒6型和7型（HHV-6和HHV-7）gB糖蛋白进行氨基酸序列比对，并构建进化树；应用在线分析软件TMHMM，ProtParam，Cysteine Connectivity Prediction Server和Prosite分别对gB糖蛋白进行跨膜预测，疏水性分析，半胱氨酸分析和潜在的N-糖基化位点分析。

2 结果

2.1 gB基因的PCR扩增结果 从4个不同来源的PCMV PCR阳性病料中，用PCMV gB全基因的特异性引物分别扩增出4个长度约为2580bp的条带，与设计的长度一致（图1）。

图1 不同地区gB基因的PCR产物

2.2 PCMV gB基因序列同源性分析 对上述PCR产物进行了PCMV gB基因序列测定，获得4个 PCMV gB 基 因 序 列 （NB200803，FJ200809，JH200810和ZZ200811），序列分析发现他们的同源性在98.1%～99.6%，差异性在0.3%～2.0%，与其他PCMV gB基因序列同源性在96.1%～99.7%，差异性在0.3%～4.1%，结果如图2。

2.3 系统进化树分析 遗传进化分析发现，整个疱疹病毒属明显的分为3个亚科，而我们所获得的来自4个不同地区的PCMV gB序列（图中●所示）均属于β疱疹病毒亚科，在β疱疹病毒亚科中，HHV-6和HHV-7与PCMV各株位于同一分支。另外，我们还发现PCMV推导的gB基因氨基酸序列出现分支，如图3。

2.4 PCMV gB糖蛋白氨基酸序列与其他PCMV以及人疱疹病毒6型和7型gB糖蛋白氨基酸序列比较 推导的gB糖蛋白氨基酸序列有11个与二硫键形成有关的半胱氨酸（除NB200803在第320位：W→C和HN，湖南序列在第522位：C→Y），其中与HHV-6和HHV-7相比，共有9个潜在保守的半胱氨酸；潜在 N-糖基化位点（Asn-X-Ser or Thr）有17个，其中ZZ200811在196～198氨基酸处出现NNT→NYT，JH200810在563～565氨基酸处出现NNS→NDS以及ZZ200811、FJ200809、HN和55b（AF268040，Spain）在835～837氨基酸处出现NTT→NDS糖基化位点变异；在其氨基端包含一个疏水区（7～19），预测其为一个信号肽区域，应用Prot Param分析蛋白的亲水性，得到的亲水性最大平均数均为负值，说明具有很强的疏水性，蛋白跨膜预测发现跨膜区序列（730～752），膜外区（1～729）和膜内区（753～860），其跨膜区序列可能为跨膜锚定序列，与gB糖蛋白在膜上的锚定作用有关；潜在裂解位点是RYKR（439～442），无连续性碱性氨基酸插入，具有低致病性病毒分子特征。HHV-6和HHV-7的裂解位点分别是RRRR（396～399）和RKRR（393～396），它们均符合共有基序R-X-R／K-R规律。

从图4可以很明显的看出，黑色圆点比较密集有3个区域：第21～46位、第241～253位和第322～339位，这3个区域，变异比较集中，我们将其定为高变区。

3 讨论

本试验对来自4个不同地区的PCMV PCR阳性病料gB基因进行了克隆与序列分析，对推导的氨基酸进行了半胱氨酸、潜在N-糖基化位点、裂解位点及疏水性和跨膜分析，发现gB基因所编码的gB糖蛋白这些生物特性类似于其他疱疹病毒gB糖蛋白［7］。此外，发现在疱疹病毒属中，PCMV gB基因序列与HHV-6和HHV-7的ORFs 36～40序列同源性最高，如图3所示，包括我们测序的4个样本在内的PCMV毒株，与HHV-6和HHV-7同属一个分支，说明它们之间具有较近的生物进化关系，但两者又处在不同的两个群，说明两者存在差异。有报道称，由于它们的细胞嗜性和细胞内DNA新陈代谢的显著差异，而导致其生物进化关系复杂而又矛盾［8-9］，PCMV与HHV-6和HHV-7具有许多相似的分子生物学特性，它们的不同之处可能源于宿主细胞的选择压力［10］。

序列分析表明，我们测得的4个PCMV gB基因序列同源性在98.1%～99.6%，差异性在0.3%～2.0%，推导的氨基酸序列同源性在97.0%～99.3%，差异性在0.7%～3.1%，相对而言其序列变异不大。与其他PCMV gB基因序列同源性在96.1%～99.7%，差异性在0.3%～4.1%，差异性偏大的原因主要来源于湖南病料的PCMV gB基因序列。推导的氨基酸同源性在96.5%～99.7%，差异性在0.3%～3.1%，与β疱疹病毒亚科中其他常见病毒的同源性在25.9%～38.1%，由此说明CMV不同种属间同源性较低。另外，我们发现在第21～46位这个高变区，HN（湖南）、ZZ200811、FJ200809和B6株（英国）的第33位由P→S，第42位由S→P，这说明它们之间发生了置换；第28位和29位由TA→ST，这是导致PCMV出现两个分支的原因之一。该分支的出现说明其gB基因变异越来越明显，并朝着两个方向变异，而且该变异呈地域化发展的趋势。

［1］陆承平.兽医微生物学［M］.3版.北京：中国农业出版社，2001：472-477.

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