pH试差法测定蓝靛果花色苷及大孔树脂纯化的研究

刘敬华，王振宇，2＊

（1.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040；2.哈尔滨工业大学 食品科学与工程学院，哈尔滨 150090）

花色苷（anthocyanin）是由花青素与糖以糖苷键结合而成的类黄酮化合物，其母核是3，5，7－三羟基－2－苯基苯并吡喃阳离子，是植物体中广泛存在的水溶性天然色素。蓝靛果 （Lonicera edulis）是东北的野生浆果，其资源丰富，研究发现［1］蓝靛果中83%的色素是矢车菊3－葡萄糖苷，其花色苷具有抗氧化、抗癌、改善视力等重要功能［2－3］，因此对这种天然色素进行纯化研究具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

蓝靛果（Lonicera edulis），采摘于大兴安岭；无水乙醇；乙酸钠，乙酸；氯化钾；盐酸；大孔树脂（AB－8，X－5，D101，D3520，NKA－9，ADS－17，NKA）。

1.2 实验仪器

电子分析天平；旋转蒸发仪；离心机；精密pH计；紫外分光光度计；层析柱（规格20×600mm）。

1.3 实验方法

1.3.1 大孔树脂的处理过程

将树脂以无水乙醇浸泡24h，使其充分溶胀，然后以乙醇冲洗至加4～5倍体积的蒸馏水无白色浑浊为止，再以蒸馏水进行冲洗，至加至4～5倍体积的无水乙醇无白色浑浊为止；再以5%的盐酸溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性；最后用2%氢氧化钠溶液浸泡12h，蒸馏水冲洗至中性备用。

1.3.2 pH 试差法的原理

花色苷发色团随pH值变化，而对花色苷颜色有干扰作用的褐色降解物则不随pH值变化。利用花色苷及黄酮的结构特性，pH值1.0时，二者在510nm处都有最大吸收峰；pH值4.5时，花色苷因为会转变为无色查尔酮形式，故在510nm处无吸收，而黄酮仍会有吸收峰［4－7］。

1.3.3 蓝靛果花色苷粗提液的制备

将冷冻的蓝靛果鲜果500g，以料液比1∶10的比例加入60%的盐酸酸化乙醇（pH2.0），50℃水浴搅拌浸提1.5h，3500r／min离心，滤渣以上述相同方法重复浸提2次，合并浸提液，真空抽滤50℃旋转蒸发后得提取液备用。

1.3.4 缓冲液的配制

pH4.5的缓冲液的制备：准确称取1.64g乙酸钠用蒸馏水定容100mL，用乙酸调pH（4.5±0.1）。

pH1.0的缓冲液的制备：准确称取1.49gKCl用蒸馏水定容至100mL。准确量取1.7mL盐酸用蒸馏水定容至100mL，配制成0.2moL／L盐酸溶液，将KCI溶液与盐酸溶液以25∶67的比例混合。用HCI溶液调pH（1.0±0.1）。

1.3.5 pH试差法的测定过程

取少量蓝靛果花色苷提取液，稀释至一定体积，进行光谱扫描，确定其最大吸收波长。取稀释后样品1mL，加入pH值为1.0、4.5的缓冲溶液9mL，40℃水浴平衡20min后，以60%的酸化乙醇为空白，于最大波长下和700nm波长下测定其吸光度，计算其粗提液的浓度并冻干计算其纯度。

1.3.6 计算

稀释后样品的吸光度ΔA按下式计算

花色苷含量按下式计算

花色苷含量（mg／mL）＝（ΔA×Mw×DF）／（ε×L）

式中：ΔA－吸光度；Mw－矢车菊3－葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；DF－样品总的稀释倍数；ε－矢车菊3－葡萄糖苷的摩尔消光系数，26900mol－1；L－比色皿光程（一般为1cm）。

花色苷纯度按下式计算：

纯度（%）＝［（C×V）／m］×100%

式中：C－花色苷的含量，mg／mL；V－花色苷的体积，mL；m－花色苷干物质的质量，mg。

1.3.7 树脂的筛选

不同树脂的物理性质有很大差别，因此它们对花色苷的吸附效果也必将有很大差别，将处理好的AB－8、X－5、D101、D3520、NKA－9、ADS－17、NKA 装入层析柱中，径长比为1∶20，上样液的浓度为1.77mg／mL，上样量为10mL；根据文献［8］确定洗脱浓度为60%的乙醇溶液，洗脱流速为1mL／min，每柱用2BV洗脱液洗脱，每20mL接一段，每柱接8段，合并每柱中颜色最深的两段，测定其浓度，筛选出纯化蓝靛果花色苷的最佳树脂。

1.3.8 洗脱剂浓度的筛选

用筛选出的最佳树脂，装入5个层析柱中，分别用30%、40%、50%、60%、70%浓度的乙醇进行洗脱，洗脱的体积为2个柱体积，每20mL接一段，每柱接8段，合并每柱中颜色最深的两段，测定其液体浓度，并将其冻干最终测定其纯度。

1.3.9 上样浓度的筛选

将蓝靛果粗提液浓度进行调整，使上样浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg／mL，用上述最佳浓度的洗脱剂进行洗脱，洗脱流速为1mL／min，用2BV的洗脱液进行洗脱，每20m为一段，每柱接8段，合并每柱中颜色最深的两段，测定其液体浓度，并将其冻干最终测定其纯度。

2 结果与分析

2.1 蓝靛果花色苷最大波长的确定

图1 光谱扫描曲线

如图1所示，蓝靛果粗提液经稀释后，经紫外扫描，在可见光区，其最大波长为峰1处的531nm，符合花色苷的最大吸收波长在可见光范围内的510～540nm附近的特征；在紫外光区，其最大吸收波长为峰2处的305nm，在300～330nm间，推测蓝靛果花色苷中可能存在酰基［4］。为测量的方便，确定其测量波长为530nm。pH试差法得其粗提液浓度为1.77mg／mL，其纯度为2.42%。

2.2 树脂的筛选

图2 不同树脂对乙醇洗脱液中花色苷含量的影响

由图2可知，弱极性的 AB－8和非极性的X－5、D101、D3520洗脱液中的花色苷的浓度较大，分别为0.264、0.311、0.340 和 0.288mg／mL，而 强 极 性 的NKA－9、ADS－17、NKA洗脱液中花色苷的浓度较小，分别为0.265、0.045和0.112mg／mL。根据文献［9］，这些强极性的树脂对花色苷的吸附率较大，而解析率却是较小造成的。

2.3 洗脱剂浓度的筛选

洗脱剂的浓度对于洗脱效果有很大影响，以洗脱后获得的较浓部分的纯度来衡量洗脱的效果。

图3 不同浓度的洗脱剂对花色苷的纯度的影响

由图3可知，在30%～70%洗脱剂的浓度范围内，随着洗脱剂浓度的X增加，所获得的洗脱物质的纯度逐渐增大，50%乙醇作为洗脱剂所获得的花色苷的最浓部分的纯度最高，达到了17.88%，乙醇浓度继续增加，花色苷的纯度反而下降，70%乙醇洗脱物中花色苷最浓部分的纯度最小，只有13.56%，这是因为花色苷中有不溶于醇的部分，被大孔树脂吸附残留于柱中而不被洗脱剂洗脱。

图4 不同的上样浓度对花色苷纯度的影响

2.4 上样浓度的筛选

由图4可知，较低浓度的上样液获得的花色苷的纯度不高，在上样液为0.5mg／mL时，洗脱液中较浓部分花色苷的纯度为12.70%，随上样浓度的增加，较浓部分花色苷的纯度开始增加，当上样浓度达到1.5mg／mL时，较浓部分花色苷的纯度达到最大值为14.70%，上样浓度继续增加，树脂的吸附能力有限，导致花色苷残留于柱隙中，在水洗时不能完全冲洗下来，因此导致花色苷的纯度有所下降，但幅度不大。在浓度为2.0和2.5mg／mL 时，花色苷的纯度分别为14.51%和14.42%。

3 结论

蓝靛果花色苷中的大部分为矢车菊花色苷，而pH试差法是以矢车菊花色苷为标准花色苷，因此pH试差法是测定蓝靛果花色苷的有效方法。

通过 pH 试差法测试 AB－8、X－5、D101、D3520、NKA－9、ADS－17、NKA七种大孔树脂洗脱液中最浓部分的浓度，发现弱极性和非极性的树脂的纯化效果较好，其中以D101树脂的纯化效果最好，洗脱液中花色苷的浓度分别是0.340mg／mL；而极性和强极性的树脂的纯化效果较差。

花色苷有易溶于水和易溶于醇的部分，因此洗脱剂的浓度不同，洗脱的效果也不同，在30%～70%洗脱剂浓度范围内，50%浓度的乙醇的洗脱效果最好。

上样浓度不同，获得的花色苷的纯度不同，浓度过大或过小，都不利于花色苷纯化，上样浓度为1.5mg／mL，获得的花色苷纯度达到最大，为14.70%。

［1］Renata Myjavcova，Petr Marhol，et al.Analysis of anthocyanin pigments in Lonicera（Caerulea）extracts using chromatographic fractionation by microcolumn liquid chromatography－mass spectrometry［J］.Journal of chromatography A，1217（2010）：7932－7941.

［2］李文星.蓝靛果花色苷提取及其抗肿瘤功能机理的初步研究［D］.哈尔滨：东北林业大学，2011.

［3］杨玲.蓝靛果提取物抗氧化及抗癌作用的研究［D］.哈尔滨：东北林业大学，2009.

［4］霍琳琳.桑葚红色素的提取纯化及结构初步鉴定［D］.杭州：浙江大学，2006.

［5］赵慧芳，王小敏，间连飞，等.黑梅果实中花色苷的提取和测定方法研究［J］.食品工业科技，2008，（5）：176－179.

［6］卢立真.紫甘薯花色苷的高效提取及抗衰老、抗糖尿病和抗肿瘤活性［D］.苏州：苏州大学，2010.

［7］唐琳，李子江，赵磊，等.两种pH值法测定玫瑰花花色苷含量的比较［J］.食品科技，2009，30（8）：310－313.

［8］赵桂红.蓝靛果天然色素提取、精制条件及稳定性研究［D］.哈尔滨：东北农业大学，2003.

［9］田福.三种野生浆果花色苷的提取、纯化及抗氧化活性研究［D］.哈尔滨：东北林业大学，2008.