光照条件对丛枝菌根真菌吸收外源氮产精氨酸的影响

刘 洁，于向鹏，刘 静，金海如

(浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004)

氮是自然界中重要的大量元素，植物需求量大，土壤供应量少，影响植物的生长和产量.给植物提供氮肥的方法包括化学施肥和生物施肥.氮的生物施肥是指利用根际细菌，包括固氮菌和根瘤菌，提高植物氮营养.丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza，AM)真菌是一类内生菌根真菌，普遍存在于世界各地［1］，与90%的维管束植物形成共生关系［2］.

很多研究表明，AM真菌的根外菌丝(extraradical mycelium，ERM)可以从环境中吸收各种形态的氮源［3-4］.AM真菌将吸收的氮源在根外菌丝中整合入精氨酸，然后转运到根内菌丝，在根内菌丝中降解，释放出无机氮，用于其他氨基酸的合成或者传递给宿主植物利用［5］.因此，菌丝和菌根中精氨酸的含量直接反映了AM真菌对植物氮营养吸收的意义.光的质量、强度和光照时间对植物的生长发育有很大的影响.光照也影响菌根的形成.强光照下洋葱接种球囊霉属真菌，菌根发育良好，丛枝数量也较多［6］.光照也可以影响AM真菌的生长.AM真菌的氮代谢近年来研究得较为清晰，但是有关光照对AM真菌氮代谢的影响尚了解甚少.为此，笔者利用三室培养盒，在3种光照条件下，在菌丝室添加不同形态的外源氮，研究了不同光照条件对AM真菌吸收同化外源氮产生精氨酸的影响，分析了不同光照对AM真菌氮代谢的影响.

1 材料与方法

1.1 材料及处理

供试菌种为根内球囊霉菌(Glomus intraradices)，由浙江师范大学微生物与发酵工程实验分室提供.宿主植物为高粱(Sorghum bicolor L.Moench，辽杂19号)，购自辽宁省东方农业科技有限公司.实验所用的基质分为2种:育苗阶段培养基质为蛭石;后期培养的基质为粒径1～3 mm的河沙.培养容器:育苗阶段使用培养杯;后期培养阶段使用三室隔离培养盒.培养盒由白铁皮做成，中间用双层的38 μm的尼龙网和铁丝网将培养盒分隔开，分别为菌根室、隔离室和菌丝室.菌根室大小为3 cm×10 cm×10 cm，菌丝室大小为5 cm×10 cm×13 cm(见图1)，菌根室比菌丝室短3 cm.中间的隔离室只允许菌丝自由地通过，阻止植物根系通过，这样既可减少养分在菌丝室和菌根室间的流动，也将菌丝和菌根分隔开.

图1 三室隔离培养盒

选取颗粒饱满的高粱种子，用10%H2O2溶液表面消毒，浸泡30 min，去离子水漂洗干净，种在盛有灭菌蛭石的培养杯中，置于培养箱中育苗.

挑选长势相同的苗移栽到菌根室.菌根室填满直径为1～3 mm的河沙，河沙经自来水反复冲洗至水澄清、蒸馏水漂洗干净、1×105Pa灭菌2 h.同时在根部添加2.5 mL的菌剂，分别置于4 800 lx(40%)，13 200 lx(60%)和 17 600 lx(80%)的光照条件下培养，此期间每5 d加一次2 mL Hoagland营养液培养30 d.再将菌丝室填满灭菌的河沙，菌根室依旧每5 d添加一次2 mL Hoagland营养液，菌丝室只加水保持湿润，培养10 d，检测菌丝生长到菌丝室中，在菌丝室中添加4 mmol/L不同形式的氮源:精氨酸(Arg)、谷氨酰胺(Gln)、尿素(Urea)和NH4NO3溶液，每5 d加一次，一次3 mL.同时，菌丝室和菌根室都加Hoagland缺氮营养液，每次2 mL.每种氮源为一个处理组，菌丝室不加氮源为对照(CK)，设置3种光照强度，每组设置3个重复，共45盆(3×5×3)，培养40 d后收获.

1.2 测定项目

高粱收获后分别收集地上部和根系.根系用蒸馏水洗净，均匀取样，剪成1 cm左右的根段，采用曲利苯蓝染色-方格交叉法测定根侵染率［7］.地上部分测量株高，挑选从上数第2片叶子测量叶绿素［8］，其余剪碎，与剩下的根一起冷冻干燥，备用.

从菌丝室均匀取50 g河沙，采用湿筛倾析技术进行孢子计数［7］.剩余的河沙采用同样的技术将菌丝筛出来，用去离子水反复冲洗，收集到离心管中，-55℃，真空度10.5 Pa冷冻干燥，备用.

冷冻干燥后的样品，取0.04 g根和5 mg根外菌丝，分别测定精氨酸含量.干燥后的茎叶0.1 g，加入消化剂消化，再用凯氏定氮仪测定其中的总氮含量.

1.3 数据分析

实验数据用SAS系统进行方差分析和样本平均数的显著性差异分析.

2 结果

2.1 根外菌丝干质量、孢子数量和菌根侵染率

光照强度可以影响菌丝室中根外菌丝的干质量、孢子数量和根侵染率，80%光照的影响明显高于60%和40%的光照.40%和60%光照对根外菌丝干质量的影响差距不大，但是不同氮源对根外菌丝干质量的影响趋势是一样的，都是以NH4NO3为外源氮时的根外菌丝干质量最大.80%光照条件下却是谷氨酰胺(Gln)对根外菌丝的干质量影响最大，达到了35.37 mg.对孢子数量的影响是:在40%光照条件下，以NH4NO3为外源氮时，孢子产量高于其他外源氮;而在60%和80%光照条件下，谷氨酰胺和尿素为外源氮时的孢子产量较高.提高光照强度可以增加孢子的数量.菌丝室施加不同的外源氮对各种光照条件下根侵染率的影响不大(见表1).

表1 不同光照条件和不同形式外源氮对根外菌丝干质量、孢子数量和菌根侵染率的影响

2.2 植物株高和叶绿素含量

在3种光照条件下，60%光照下植物的株高和叶片叶绿素含量均高于其他2个光照条件;80%光照下植物长势较矮，但是植株较粗壮，叶片叶绿素含量最低.NH4NO3为外源氮时，叶绿素含量最低;40%与60%光照下尿素为外源氮时，叶绿素含量最高;但80%光照下则是精氨酸为外源氮时叶绿素含量最高(见表2).

表2 不同光照条件和不同形式外源氮对AM真菌宿主植物叶绿素和株高的影响

2.3 茎叶中总氮含量

AM真菌从外界吸收外源氮转运给植物［5］.外源氮的添加会对植物含氮量有一定的影响.由图2可以看出:60%光照条件下，植物的含氮量比其他2个光照下有明显的优势，尿素为外源氮时茎叶的氮含量最高，达到了29.96 g/kg;40%光照下也是尿素对植物总氮含量的影响最大，表现为Urea＞Gln＞Arg＞NH4NO3;而80%光照下植物的氮含量明显低于其他2个光照下，大约只有其他2种光照下的1/3，而且菌丝室加不同外源氮之间也没有显著差异.

图2 不同光照和氮源对茎叶中氮含量的影响

2.4 菌根和菌丝中精氨酸含量

图3 不同光照和氮源对菌丝中精氨酸含量的影响

图4 不同光照和氮源对菌根中精氨酸含量的影响

精氨酸是AM真菌氮转运的有机氮载体，吸收的外源氮存储于精氨酸中，再从根外菌丝输送到根内菌丝中［9］.由图3和图4可以看出，菌根中的精氨酸含量明显比根外菌丝中的高很多.60%光照下根外菌丝中精氨酸含量最高，40%光照下次之，80%光照下最低;60%光照和不同外源氮处理下，根外菌丝中精氨酸的含量不同，表现为Arg＞Gln＞Urea＞NH4NO3(见图 3).但是，菌根中精氨酸含量受光照影响大小顺序是80%＞60% ＞40%;80%光照下，不同形态的外源氮对菌根中精氨酸含量的影响为NH4NO3＞Gln＞Arg＞Urea(见图4).

3 讨 论

大量研究表明，磷元素营养与菌根形成的关系最为密切［10］，氮素营养也会影响AM真菌的生长［11］.本实验固定了氮和磷的浓度，仅改变光照强度，发现不同的光照强度对AM真菌的生长也是有影响的.因为强光照可以促进植物的光合作用，植物光合的净同化率提高，从而增加了根内碳水化合物如蔗糖等可溶性糖的含量，促进了植物新根的萌发和生长，因而有利于菌根的形成，最终促进了孢子和菌丝的生长.

3.1 不同光照和外源氮对AM真菌吸收外源氮产精氨酸的影响

本实验中，同一处理下菌根中的精氨酸含量是菌丝中的几倍.因为AM真菌可以吸收外源氮，在AM真菌中外源氮转化为精氨酸，以精氨酸的形式运输到根内菌丝中，在根内菌丝中积聚［5］.这就是菌根中精氨酸含量高于根外菌丝中的原因.在菌丝中，80%光照下的精氨酸含量最低;但在菌根中恰恰相反，80%光照下的精氨酸含量最高.60%光照下，菌丝中的精氨酸含量高于其他2个光照下的;但是菌根中精氨酸含量介于另2个光照的中间.可能是因为光照强度直接影响光合作用，强光照提高了光合作物的产量和速率，宿主植物将其光合作用产物向下传递给AM真菌［7］的量与速率也提高，根内菌丝中的碳骨架需要大量的精氨酸，进而促进根外菌丝吸收外源氮合成精氨酸并转运到根内菌丝中，在根内菌丝中积累.光照越强，转运速度越快.

在80%光照下，以NH4NO3为外源氮时，菌丝和菌根中精氨酸含量最高，这与报道的AM真菌优先利用的结果相同.而精氨酸和谷氨酰胺为外源氮时，菌根和菌丝中精氨酸含量次之，高于尿素处理的.可能是因为虽然根外菌丝吸收精氨酸和谷氨酰胺需要消耗一定的能量，但是吸收后，精氨酸可以直接运输到根内菌丝，谷氨酰胺也可以直接合成精氨酸后转运到根内菌丝中.空白处理的精氨酸含量很低，表明了AM真菌的根外菌丝可以吸收不同的外源氮产生精氨酸.

在60%和40%光照条件下，以精氨酸和谷氨酰胺为外源氮时，菌丝和菌根中的精氨酸含量较高;而以尿素和NH4NO3处理时，精氨酸含量较低.这与文献［12］报道的根外菌丝吸收NH+4比氨基酸的能力更强的结果不一致，与文献［14］盆栽条件下的研究报道一致.这可能是因为培养的方式不同所致.本实验采取的盆栽培养，处理时间较长，可能有微生物滋生.矿化作用使有机氮源降解成为易吸收的形式，这种形式可能处于NH+4同化为精氨酸之间的一种产物，既利于根外菌丝的吸收，又可以省略很多同化为精氨酸的步骤，加快了吸收同化的速率.

不同光照条件下菌丝和菌根中的精氨酸含量受氮源种类的影响，但是不同光照对不同氮源的影响不同，说明光照强度不仅可以影响AM真菌的生长繁殖，也可以影响共生体系对营养的吸收.

3.2 AM真菌促进植物氮吸收

有研究表明，AM真菌可以吸收氮素，并且向宿主植物传递［15］.本实验中，空白处理的植物茎叶含氮量明显低于其他菌丝室添加氮源的，也证实了这一点.60%和40%光照下，尿素为外源氮时，植物茎叶总氮含量最高.值得关注的是，80%光照条件下植物的总氮含量很低，大概是另外2种光照下的1/3，且各种氮源处理间没有显著差异.造成这种现象的原因，可能是光照较强时虽然影响了叶绿素的合成，但是光合作用产物较多，提供给菌根的碳骨架较多，在菌根内的精氨酸降解释放出的NH+4都在菌根内合成其他的氨基酸，并没有运输到植物体内，导致植物茎叶中含氮量低于其他2个光照下的.这也与80%光照下菌根中精氨酸含量很高相符.强光照虽然促进了AM真菌吸收同化外源氮产生精氨酸，但是却抑制了AM真菌和宿主植物之间的氮转移.所以，光照强度对AM真菌吸收氮元素的促进作用是在一定光照范围之内的.光照强度对AM真菌促进植物氮吸收的影响不容忽视.

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