芍红消积颗粒的质量标准研究Δ

弓晓东，谈瑄忠，毛春芹，陆兔林，苏丹（.南京中医药大学药学院，南京20046；2.南京市中医院，南京 2000）

芍红消积颗粒由赤芍、红花、黄芪等11味药组成，具有活血化瘀、清热利湿之功效，用于治疗湿热瘀阻型子宫内膜异位症引起的痛经，伴见月经过多或经期延长等。临床研究发现，该方能改善全身和局部血液循环、降低血浆前列腺素含量和抑制异位内膜生长，对子宫内膜异位症具有良好的疗效[1]。笔者对本品进行质量标准的制定，对赤芍等4味药材进行薄层色谱（TLC）鉴别；同时由于赤芍是本方主药，芍药苷是赤芍饮片中主要成分之一，因此采用高效液相色谱（HPLC）法测定方中芍药苷的含量，以便有效控制产品质量，提高临床疗效。

1 仪器与试药

1100 HPLC仪、VWD检测器（美国安捷伦公司）；FA1104万分之一电子分析天平（上海天平仪器厂）；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）；水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）；WD-9403C紫外分析仪（北京市六一仪器厂）；KQ-500B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

芍药苷对照品和赤芍、三棱、黄芪、黄芩对照药材（中国食品药品检定研究院，批号分别为110736-200427、121093-200405、121521-200602、120974-200407、120955-200305）；芍红消积颗粒（批号：090916、090918、090920）和相应阴性样品均由南京中医药大学药学院自制；水为重蒸水，乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 赤芍的TLC鉴别 取本品1.3 g，加70%甲醇20 mL，超声（功率：500 W，频率：40 kHz）30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液；另取赤芍对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液；再取缺赤芍阴性样品1.3 g，同法制成阴性对照溶液。照TLC法[2]试验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯（8∶4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，于105℃加热至斑点显色清晰[3]。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性对照无干扰。赤芍的TLC见图1。

2.1.2 三棱的TLC鉴别 取本品5 g，加乙醚30 mL，加热回流0.5 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为供试品溶液；另取三棱对照药材1 g，同法制成对照药材溶液；再取缺三棱的阴性样品5 g，同法制成阴性对照溶液。照TLC法[2]试验，分别吸取上述溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯（8∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视[4]。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。三棱的TLC见图2。

2.1.3 黄芪的TLC鉴别 取本品 12 g，加水 40 mL，超声（功率：500 W，频率：40 kHz）30 min，过滤，滤液用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次20 mL，弃去氨试液，分取正丁醇振摇提取液，水浴蒸干，残渣加蒸馏水3～5 mL使溶解，通过D101大孔树脂柱（内径1.5 cm，长12 cm），加水50 mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 mL洗脱，弃去乙醇洗脱液，再用70%乙醇50 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇定容至2 mL，作为供试品溶液；取黄芪对照药材4 g，同法制成对照药材溶液；再取缺黄芪的阴性样品2 g，同法制成阴性对照溶液。照TLC法[2]试验，分别吸取上述溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-水（30∶10∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰[5]。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。黄芪的TLC见图3。

图1 赤芍的TLC1.赤芍对照药材；2～4.供试品；5.阴性对照Fig 1 TLC of Paeoniae Radix Rubra1.Paeoniae Radix Rubra reference substance；2～4.test samples；5.negative control

图2 三棱的TLC1.三棱对照药材；2～4.供试品；5.阴性对照Fig 2 TLC of Sparganium stoloniferum1.Sparganii Rhizoma reference substance；2～4.test samples；5.negative control

图3 黄芪的TLC1.黄芪对照药材；2～4.供试品；5.阴性对照Fig 3 TLC of Astragali Radix1.Astragali Radix reference substance；2～4.test samples；5.negative control

图4 黄芩的TLC1.黄芩对照药材；2～4.供试品；5.阴性对照Fig 4 TLC of Scutellaria baicalensis1.Scutellariae Radix reference substance；2～4.test samples；5.negative control

2.1.4 黄芩的TLC鉴别 取本品5 g，研细，加甲醇40 mL，超声（功率：500 W，频率：40 kHz）20 min，滤过，滤液挥干，残渣加水50 mL使溶解，离心（4 800 r·min-1，15 min），倾出上清液，盐酸调pH值为1～2，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯提取液，水浴蒸干，残渣用甲醇定容至1 mL，作为供试品溶液；另取黄芩对照药材1 g，同法制成对照药材溶液；再取缺黄芩的阴性样品5 g，同法制成阴性对照溶液。照TLC法[2]试验，分别吸取上述溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性对照无干扰。黄芩的TLC见图4。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（30∶70）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。理论板数按芍药苷色谱峰计算应不低于3 000，分离度＞1.5。在此条件下，芍药苷色谱峰与其他组分峰可达基线分离，供试品与芍药苷对照品在相同时间点出现同一色谱峰，而阴性对照未出现色谱峰[6]。色谱见图5。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的芍药苷对照品5.21 mg，置10 mL容量瓶中，加流动相制成每1 mL含0.521 mg的溶液，摇匀，定容，作为对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定重量，回流30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足失重，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得。

2.2.4 标准曲线的制备 精密量取浓度为0.521 mg·mL-1的芍药苷对照品溶液，加甲醇依次稀释成浓度为0.052 1、0.104 2、0.208 4、0.312 6、0.416 8、0.521 0 mg·mL-1的系列溶液，各取10 μL进样，按上述色谱条件测定。以检测浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y＝13 541.05X－25.34（r＝0.999 8，n＝6）。结果表明，芍药苷检测浓度在0.052 1～0.521 0 mg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 取芍药苷对照品溶液适量，按上述色谱条件重复进样6次，测定峰面积。结果，RSD＝0.53%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液适量，在室温下放置0、2、4、6、8、10 h，按上述色谱条件测定。结果，RSD＝0.85%（n＝6），表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.2.7 重复性试验 精密称取同一批芍红消积颗粒样品适量，共6份，分别按“2.2.3”项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件测定。结果，芍药苷的平均含量为5.334 2 mg·g-1，RSD＝1.25%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量（含量：5.334 2 mg·g-1）的样品共9份，每份0.3 g，分别置于具塞锥形瓶中，每3份一组，分别加入芍药苷对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL（重新制备芍药苷对照品溶液，浓度为1.538 mg·mL-1），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算加样回收率。结果，平均回收率为97.49%，RSD＝1.80%（n＝9）。

2.2.9 样品含量测定 取3个批号的样品适量，每批平行取样3份，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，以外标两点法测定并计算芍药苷的含量，结果见表1。

图5 高效液相色谱图A.芍药苷对照品；B.供试品；C.缺赤芍阴性对照Fig 5 HPLC chromatogramsA.paeoniflorin control；B.test sample；C.negative control without Paeoniae Radix Rubra

表1 样品含量测定结果（n＝3）Tab 1Content determination of samples（n＝3）

3 讨论

3.1 前期处理

药材来源及其品质的好坏直接影响成品制剂的质量，不同产地的药材含量均有差异，即使一地所产药材，也会因为采收时间、贮藏、运输等条件的不同而出现很大的差异。在整个项目研究中，一方面围绕着药材来源及含量测定，保证制剂原料符合药典规定；另一方面最大限度的保证指标性成分的转移率，最终得出最佳工艺。

3.2 TLC鉴别

芍红消积颗粒是一个复方制剂，成分较为复杂，影响鉴别的干扰因素较多。通过参考文献和预试验，对方中赤芍等进行TLC鉴别，得到理想的TLC条件。在对红花、昆布、蒲公英3味药材进行TLC鉴别时，供试品在与对照药材相同位置处可见明显同一斑点，但阴性对照有干扰，尤其是红花的鉴别，采用了3种试验方法都不能很好鉴别，推测该检测成分可能在制剂中其他药材中也存在，故鉴别较复杂，这一问题有待进一步研究[7]。本试验也探讨了制剂中土鳖虫的TLC鉴别[8]，采用在展开前，展开箱先用展开剂预平衡和加大点样量等方法，均没有特征斑点出现，推测该检测成分可能在制剂工艺中损失严重。

3.3 含量测定

对赤芍中的芍药苷进行含量测定时，笔者比较了依利特Hypersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），分别采用同一色谱条件进行分离。结果表明，Kromasil C18柱各峰间分离度、对称性好，分离效果为佳。在检测芍药苷成分时，考察了不同流动相对峰形的影响，当流动相用甲醇时，峰严重拖尾，分离度差；采用甲醇-水（45∶55）时，峰形对称，但保留时间过短，分离度不好；用甲醇-水（30∶70）为流动相，分离峰形对称，保留时间适中，分离效果为最佳。

本试验所建立的赤芍等药材的TLC鉴别方法，无干扰，具有专属性；HPLC定量芍药苷的方法简单、准确、专属性强、重复性好，均可用于芍红消积颗粒的质量分析与控制，但在芍药苷含量限度方面有待进一步深入研究。

[1]吴 婷.化瘀消痰法治疗子宫内膜异位症痛经临证研究[J].辽宁中医杂志，2003，30（10）：807.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录34.

[3]杨婉花，郝晓静，李 娟，等.双白片质量标准研究[J].中国药房，2010，21（27）：2 549.

[4]苗明三，李振国.现代实用中药质量控制技术[M].北京：人民卫生出版社，2000：47.

[5]申桂霞.玉液消渴冲剂中黄芪葛根的薄层鉴别[J].中医药导报，2007，13（7）：92.

[6]杨 翰，王海宁，刘丰丰.HPLC法测定舒心宁片中芍药苷的含量[J].中国药房，2007，18（24）：1 885.

[7]陈卫军，王新春，袁 勇，等.复方当归红花酊的薄层色谱鉴别[J].时珍国医国药，2004，15（6）：343.

[8]张 颖，杨松松，桑育黎，等.红药片定性鉴别方法研究[J].中华中医药学刊，2007，25（5）：986.