正交试验优选杜仲多糖提取工艺Δ

史秀玲，高银辉，梁海英，周程艳（.河北乐亭县医院，河北乐亭063600；.唐山市丰润区中医院，河北唐山 064000；3.沈阳药科大学，沈阳 006）

正交试验优选杜仲多糖提取工艺Δ

史秀玲1＊，高银辉1，梁海英2，周程艳3#（1.河北乐亭县医院，河北乐亭063600；2.唐山市丰润区中医院，河北唐山 064000；3.沈阳药科大学，沈阳 110016）

目的：优选杜仲多糖的提取工艺。方法：用普通水提醇沉法和微波提取法分别提取杜仲多糖，以提取温度、提取时间、料液比、提取次数为考察因素，以多糖提取率为评价指标，采用正交试验优选工艺。结果：普通水提醇沉法的最佳工艺为温度120℃、时间2h、料液比1∶8、次数3次；微波提取法的最佳工艺为温度50℃、时间45min、料液比1∶20、次数3次。结论：微波提取法对杜仲多糖的提取有辅助作用，较普通水提醇沉法更优。

杜仲多糖；水提醇沉法；微波提取法；正交试验

杜仲Eucommia ulmoides Oliv.，古称“曼榆”，又名“木棉”，为杜仲科杜仲属的落叶乔木，传统上用皮入药，为我国特有的单科目、单属科、单种属植物，已经有2000多年的栽培历史[1]。近些年的研究发现，杜仲的主要化学成分有木脂素、环烯醚萜类、苯丙素类、黄酮类、三萜类、多糖类等，其中杜仲多糖是近年来发现的活性成分。但目前杜仲多糖的研究主要是含量测定和药理作用，对其提取的研究较少而且提取效果不好。因此，笔者以杜仲茎皮的干燥粉末为原料，采用正交设计分别对普通水提醇现法和微波提取法的提取工艺进行优化，以为杜仲多糖的进一步研究提供科学依据。

1 仪器与试药

DHG-9101.2电热恒温鼓风干热箱（金坛市荣华仪器制造有限公司）；XH-100B微波化学合成仪/萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司）；TU-180紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；BT125D十万分之一电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；FA2104N万分之一电子天平、FA2104N普通电子天平（上海民桥精密仪器厂）；MAS-I微波萃取仪（上海新仪微波化学科技有限公司，功率：250W，频率：40kHz）。

杜仲茎皮和叶，购于唐山市药材有限公司，经河北联合大学中药学院中医教研室包巨太教授鉴定为真品，药材经80℃干燥6h，粉碎后备用；苯酚、碳酸氢钠、铝片、葡萄糖、浓硫酸均为分析纯。

2 方法

2.1 杜仲多糖的提取

称取杜仲样品10g，干燥，粉碎至一定粒度，置于圆底烧瓶中，分别用水提醇沉和微波提取的方法提取。残渣按一定料液比、提取温度、提取时间、提取次数，采用水提或微波浸提一段时间，去上清液浓缩后以95%乙醇沉淀，离心取沉淀物，无水乙醇洗涤数次，干燥，即得杜仲粗多糖。按下式计算多糖提取率：多糖提取率（%）＝多糖重量/杜仲样品重量×100%。

2.2 多糖含量测定

2.2.1 标准曲线的制备 精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖100.6mg，置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1.006mg·mL-1的葡萄糖标准品溶液。精密吸取此标准品溶液 0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0mL，分别置于25mL容量瓶中，加去离子水稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述各种溶液2.0mL，分别加入5%的苯酚溶液1.0mL，摇匀，迅速加入5.0mL浓硫酸，振摇5min，置于沸水浴中加热15min，然后置于冷水浴中冷却30min。以去离子水2mL按上述条件处理的溶液作为空白，参考文献数据[2，3]，选择在481nm波长处测定吸光度。以葡萄糖检测浓度（Y）为横坐标，吸光度（X）为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y＝14.285X－0.123（r＝0.9953，n＝12）。结果表明，葡萄糖检测浓度在0.032～0.120mg·mL-1范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.2.2 供试品溶液的制备 取正交试验项下各样品溶液适量，按“2.2.1”项下自“精密吸取此标准品溶液”起处理各样品溶液，即得各供试品溶液。

2.2.3 精密度试验 精密量取上述标准品溶液2mL，按“2.2.1”项下方法重复测定6次。结果，RSD＝0.50%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性试验 精密量取供试品溶液2mL，在0、30、60、90、120、150min时，按“2.2.1”项下方法测定。结果，RSD＝0.06%（n＝6），表明供试品溶液在显色操作完成后150min内基本稳定。选择测定时间为反应显色后30min。

2.2.5 重复性试验 取样品溶液适量，分别按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下方法测定。结果，RSD＝1.43%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.2.6 加样回收率试验 取所提取的已知多糖含量的供试品溶液（含量：55.67%，取样量：2mL）6份，分别置于试管中，加入1.006mg葡萄糖标准品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率。结果，平均回收率为102.5%，RSD＝0.86%（n＝6）[4，5]。

2.3 普通水提醇沉工艺的优选

根据单因素试验结果，以提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）、提取次数（D）为考察因素，根据L9（34）正交表设计试验，并测定多糖含量，计算多糖提取率。以多糖提取率为评价指标优选工艺。因素水平见表1；正交试验结果见表2；方差分析结果见表3。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交试验结果Tab 2 Results of orthogonal experiment

由表2、表3可知，各因素对提取效果的影响主次顺序为提取时间＞提取温度＞料液比＞提取次数，且前3个因素对工艺均有显著性影响（P＜0.05）。最佳提取工艺为A3B2C2D3，即温度120℃、时间2h、料液比1∶8、提取3次。在此条件下，多糖提取率为22.54%。

2.4 微波提取工艺的优选[6]

根据单因素试验结果，以提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）、提取次数（D）为考察因素，根据L9（34）正交表设计试验，测定多糖含量，并计算多糖提取率。以多糖提取率为评价指标优选工艺。因素水平见表4；正交试验结果见表5；方差分析结果见表6。

表3 方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis

表4 因素水平Tab 4 Factors and levels

表5 正交试验结果Tab 5 Results of orthogonal experiment

表6 方差分析结果Tab 6 Results of variance analysis

由表5、表6可知，各因素对提取效果的影响主次顺序为提取温度＞料液比＞提取次数＞提取时间，且除提取时间外的其他因素对工艺均有显著性影响（P＜0.05）。最佳提取工艺为A3B2C1D3，即温度50℃、时间45min、料液比 1∶20、次数3次。在此条件下，多糖提取率为23.40%。

3 讨论

在对普通水提和微波提取法进行比较研究后发现，2种方法下杜仲多糖的提取率无太大差别，但微波提取法可节省50%～90%的时间；另外，微波提取法可有效保护食品、药品以及其他化工物料中的功能成分，提取物质量高；对萃取物具有高选择性；耗能低。故微波提取法较优[7，8]。

本试验表明，利用微波提取法提取杜仲多糖是可行的，各影响因素中，提取温度影响最大，温度低，多糖溶出速度慢；温度高，多糖溶出速度快，同时蛋白质等杂质的生成量也大大增加，为后续处理带来不便，所以温度在50℃较合适。其次是料液比，当料液比为1∶20时提取效率较好，且节省溶剂。再次是提取次数，提取次数越多提取率越高，但考虑提高效率，一般提取3次。最后是提取时间，加热45min比较合适，加热时间短，多糖没有完全溶出；加热时间长，多糖又被机械剪切成小分子而损失掉。综上所述，微波提取法的最佳工艺条件为温度50℃、时间45min、料液比1∶20、次数3次。

[1] 王景祥.杜仲叶和杜仲皮的成分比较[J].中草药，1987，18（3）：11.

[2] 陈锦鹏，林晓翠，王碧玉，等.仙草多糖提取工艺研究[J].化学工程与装备，2009，3（3）：1.

[3] 周程艳，马红翠，王 美，等.不同采收期杜仲叶和果实中总黄酮和多糖含量比较[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（11）：111.

[4] 赵晓明，张鞍灵，张 檀，等.杜仲叶多糖研究[J].西北林学院学报，1999，14（4）：73.

[5] 沈 蔚，任晓婷，张 建，等.芦根多糖的提取及抗氧化活性的研究[J].时珍国医国药，2010，21（5）：1078.

[6] 杜敏华，田 龙.微波辅助法提取杏鲍菇多糖研究[J].食品科学，2007，3：117.

[7] 梁 莉，王 婷，乔 华，等.南沙参中多糖的含量测定[J].中国药房，2011，22（11）：1001.

[8] 李柏群，邱建平，彭 腾，等.风芍六君子汤不同配伍水煎液中多糖的含量测定[J].中国药房，2010，21（7）：628.

Optimization of the Extraction Process for Eucommia ulmoides Polysaccharides by Orthogonal Test

SHI Xiu-ling，GAO Yin-hui（Leting County Hospital of Hebei Province，Hebei Leting 063600，China）
LIANG Hai-ying（Tangshan Fengrun District Hospital of TCM，Hebei Tongshan 064000，China）
ZHOU Cheng-yan（Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction process for Eucommia ulmoides polysaccharides（EOP）.METHODS：Aqueous extraction and microwave extraction were used for the extraction of E.ulmoides polysaccharides.The extraction technology of E.ulmoides polysaccharides was optimized by orthogonal test with extraction temperature，extraction time，solid-liquid rate and extraction times as factors using extraction rate as index.RESULTS：The optimum process conditions with aqueous extraction were as follows：extraction temperature of 120℃，extraction time of 2h，solid-liquid ratio of 1∶8，extracting for 3times.The optimum process conditions with microwave extraction were as follows：extraction temperature of 50℃，extraction time of 45min，solid-liquid ratio of 1∶20，extracting for 3times.CONCLUSION：Microwave-assisted extraction is helpful to extract E.ulmoides polysaccharides，and it is better than aqueous extraction.

Eucommia ulmoides polysaccharides；Aqueous extraction；Microwave extraction；Orthogonal test

R284.2；R283

A

1001-0408（2012）03-0223-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.03.11

Δ唐山市科学技术研究与发展指导计划项目（111302098a）

＊副主任中药师。研究方向：中药有效成分及中药药理。电话：0315-4620295。E-mail：sxlxyy@163.com

#通讯作者：副教授，博士研究生。研究方向：中药药效和有效成分筛选。E-mail：xuefanone@sohu.com

2011-09-15

2011-12-05）