清开灵注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

赵丽红 卜丽梅 于艳华 李琼书 石 卓 (吉林大学白求恩医学院，吉林 长春 30000)

氧自由基(OFR)对组织细胞的损害是引起再灌注损伤的重要因素之一〔1〕，药物预处理对缺血再灌注(I/R)损伤心肌的保护亦成为目前的研究热点。清开灵(QKL)注射液为传统中药制剂，对脑I/R损伤具有保护作用〔2〕，但对心肌I/R损伤是否有作用未见报道。本实验通过观察麻醉开胸大鼠心肌I/R损伤模型心肌形态学、血清酶学及抗自由基等指标的变化，探讨QKL注射液对心肌I/R损伤的保护作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 雄性Wistar大白鼠，清洁级，体重250～280 g，吉林大学基础医学院实验动物中心提供。QKL注射液由北京中药厂出品;乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷草转氨酸(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、氧化氮(NO)试剂盒均由南京建成生物工程技术公司提供。COBAS-FARA型自动生化分析仪(瑞士)，HX-200小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)，ECG-6511心电图机(上海光电医用电子仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及动物模型制备 取Wistar雄性大鼠40只，体重250～280 g，随机均分四组，每组10只。20%乌拉坦(0.5 ml/100 g)麻醉，仰卧位固定，颈部正中分离气管行气管插管，开胸后接呼吸机。小动物呼吸机设定潮气量为5 ml/100 g、呼吸频率为68次/min，吸呼比为2∶1，根据呼吸频率及深度调整呼吸参数。沿胸骨左缘做纵向切口，在3～4肋间开胸，暴露心脏，在左冠状动脉前降支距左心耳下缘1.5～2 mm处穿线，15 min后取心电图正常者随机分组，每组10只，即假手术组、模型组、QKL注射液高剂量组(40 mg/kg)及低剂量组(20 mg/kg)。假手术组:冠状动脉下穿线不结扎。模型组:结扎左冠状动脉前降支，以心电图ST段明显抬高并与QRS波融合为成功标志。QKL注射液高剂量组:舌下静脉给药40 mg/kg，15 min后结扎左冠状动脉前降支。QKL注射液低剂量组:舌下静脉给药20 mg/kg，15 min后结扎左冠状动脉前降支。以上各结扎组缺血40 min后，均打开结扎线形成再灌注2 h。

1.2.2 检测大鼠血清LDH、CK、AST、SOD、MDA及NO含量上述实验结束后，由腹主动脉取血5 ml置于玻璃试管中，并立即离心(4℃，3000 r/min，10 min)分离血清，按 LDH、CK、AST、SOD、MDA及NO试剂盒说明书操作，采用自动生化测定仪，在340 nm处检测血清LDH、CK、AST、SOD、MDA及 NO含量。

1.2.3 检测并计算大鼠心肌损伤范围 腹主动脉采血后，迅速剪下心脏，横向将心脏切5～6片，每片厚约1.5～2 mm，放入1%氯化三苯基四氮(TTC)磷酸缓冲液(pH7.4)，37℃水浴10 min，损伤的心肌细胞因细胞膜损伤脱氢酶释放丢失，因而不被染色;正常心肌含有脱氢酶可被染为红色。应用BI2000软件处理系统计算各部分面积，以各片非染色区面积之和与各片室壁面积之和的百分比反映心肌损伤范围。

1.2.4 免疫组化法检测大鼠心肌诱导型NO合酶(iNOS)的表达 取心尖缺血梗死区横切2 mm厚心肌，以磷酸盐缓冲液(PBS)配成10%甲醛溶液固定，以链霉菌素-生物素免疫组化(SP)法观察心肌细胞iNOS表达。操作步骤如下:(1)石蜡切片常规脱蜡至水;(2)3%H2O2常温下孵育10 min以灭活内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，PBS浸洗5 min;(3)加山羊血清封闭液，室温15 min清除背景非特异性染色;(4)滴加兔抗鼠iNOS抗体37℃孵育1 h;(5)滴加生物素标记羊抗兔IgG，37℃孵育30 min;(6)加辣根酶标记链霉素卵白素，37℃孵育30 min;(7)上述(3)、(4)、(5)后均以 PBS洗3 min×3次;(8)二氨基联苯胺(DAB)显色，自来水充分冲洗，苏木素复染，封片。阴性对照以PBS代替一抗进行孵育，其他步骤同上。阳性反应:细胞质呈棕褐色为iNOS蛋白阳性表达。Image-pro软件分析计算各组阳性表达细胞的光密度值。

2 结果

2.1 QKL注射液对大鼠血清CK、LDH、AST、SOD、MDA及NO含量的影响 与假手术组

比较，模型组血清CK、LDH及AST活性明显升高(P＜0.01);与模型组相比，QKL能降低血清CK、LDH及AST的活性(P＜0.05)。与假手术组比较，模型组大鼠血清中 SOD活性降低，NO、MDA含量明显增加(P＜0.01);与模型组比较，QKL各组大鼠血清中SOD活性明显升高(P＜0.01)，MDA含量和NO含量明显降低(P＜0.01)。见表 1，表 2。

表1 QKL注射液对大鼠血清CK、LDH及AST的影响(n=10， ± s，U/L)

表1 QKL注射液对大鼠血清CK、LDH及AST的影响(n=10， ± s，U/L)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05

328.12±159.4 330.3±64.2 104.4±40.6模型组 1230.4±213.51)1193.0±223.11)436.0±106.41)QKL高剂量组 886.3±97.81)2)894.25±280.31)2)294.7±67.51)2)QKL低剂量组 857.9±118.31)2)776.9±312.41)2)304.1±66.61)2)CK LDH AST假手术组组别

±s)表2QKL注射液对大鼠血清SOD、MDA及NO的影响(n=10，

±s)表2QKL注射液对大鼠血清SOD、MDA及NO的影响(n=10，

与假手术组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01;下表同

组别 SOD(U/ml) MDA(μmol/L) NO(μmol/L)168.04±4.58 5.40±0.86 12.45±2.16模型组 106.22±5.921) 10.92±1.121) 25.3±8.11)QKL高剂量组 135.31±9.321)2)6.98±1.131)2) 16.2±3.01)2)QKL低剂量组 131.56±8.661)2)7.94±0.951)2) 17.7±4.81)2)假手术组

2.2 QKL注射液对心肌损伤范围的影响 与假手术组比较，模型组心肌梗死面积(MIS)〔(42.30±2.5)%〕明显增大(P＜0.01)，表明大鼠心肌I/R模型建立成功。与模型组相比，QKL(40 mg/kg)组及 QKL(20 mg/kg)组均能明显缩小 MIS〔(32.16±3.8)%，(31.43±4.6)%，P ＜0.05〕。

2.3 QKL对iNOS的影响 镜下可见iNOS主要在胞质中表达，阳性细胞被染成棕黄色。I/R后各组心脏心肌均出现iNOS表达增强，模型组iNOS染色阳性细胞数(92.33±11.34)高于假手术组(40.15±5.69，P＜0.01)，而 QKL高、低剂量组(73.92±14.29，76.76±12.45)与模型组比较阳性细胞数减少(P＜0.01)，胞质表达的棕黄颗粒明显减少。

3 讨论

本研究采用人工结扎大鼠冠脉左前降支制备心肌急性心肌I/R损伤模型，急性心肌梗死后，各项心功能改变及其恢复程度和速度均与MIS呈负相关，故缩小MIS为抗心肌缺血药物的主要疗效指标。此外，心肌发生缺血坏死，其生理功能、生化代谢方面也随之发生相应变化。一般认为，阻断冠脉血流20～30 min内重新供血，心肌病变可以逆转，但长时间缺血缺氧会导致心肌组织细胞损伤，使广泛存在于心肌组织细胞内的CK和LDH释放出来并扩散入血，血清CK、LDH活性显著升高，其升高程度与心肌梗死程度相平行。因此，血清CK、LDH水平是心肌损伤的灵敏指标〔3〕。本研究证明，QKL能降低心肌缺血大鼠血清CK和LDH活力，表明其可减轻细胞损伤，并且与其缩小MIS的结果一致。

心肌组织I/R后，细胞膜脂质微环境发生紊乱，自由基大量产生及自由基引发的脂质过氧化作用增强，同时自由基生成和自由基消除之间的平衡被破坏，自由基严重增多，自由基清除剂SOD减少，而活性很强的OFR与细胞膜上的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，其过氧化产物MDA对膜有很强的破坏作用，可破坏心肌细胞膜的完整性，改变心肌超微结构，从而加剧心肌缺血，导致心肌细胞损伤〔4〕。检测MDA含量可反映机体内脂质过氧化程度，间接反映出细胞损伤的程度。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，它们是OFR的特异性降解酶，该酶能清除OFR保护细胞免受损伤，其活力的高低间接反映了机体清除OFR的能力。心肌缺血再灌注损伤时早期主要表现为心肌酶漏出。其中血清CK以灵敏度高、特异性强、发生变化时间早、持续时间长的特点而经常作为首选酶，临床常把CK作为诊断心肌梗死和判断其梗死程度的指标之一〔5〕。本实验结果显示，QKL能升高结扎冠脉引起的急性心肌缺血大鼠血清中LDH的含量，减少MIS，表明QKL能增强机体对OFR的清除能力，减少细胞膜脂质过氧化损伤，维持膜结构的完整性，抑制细胞内CK外漏，从而对心肌细胞膜起到保护作用，减少LDH的释出，缩小MIS。

过量的NO能与超氧自由基或O2形成过氧亚硝酸根离子(ONOO－)和羟自由基(OH)，损伤线粒体膜，使线粒体形成瘘道，开放线粒体转换孔，致使离子平衡紊乱，大量的Na+和Cl－进入细胞内，导致细胞内水增加引起细胞肿胀，ATP能量合成终止，导致细胞坏死和凋亡〔6〕。NO的毒性作用还表现在通过产生大量的OH－和二氧化氮自由基，直接造成蛋白质、核酸、膜脂质的损伤，抑制各种与线粒体电子传递有关的酶类，从而抑制线粒体呼吸链的功能〔7〕，最终导致细胞坏死或凋亡。本实验发现，假手术组心肌组织iNOS活性增加，提示I/R诱发iNOS系统功能紊乱，与iNOS活性相关的NO合成增加，将发挥NO的细胞毒性作用。QKL组预处理后iNOS活性下调，这可能因为QKL可保护血管内皮细胞并逆转NOS系统的功能紊乱，减少再灌注期由iNOS诱导的NO生成，从而抑制ONOO－生成及细胞损伤，对心肌I/R损伤具有一定的保护作用。

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2 黄真炎，吴玲霓，杨冬娣，等.清开灵对大鼠急性脑缺血超微结构的保护作用〔J〕.中医药研究，1997;13(5):57-8.

3 黄秀兰，王 伟，周亚伟.淫羊藿总黄酮注射液对大鼠实验性心肌缺血的保护作用〔J〕.中国中西医结合杂志，2006;26(1):68-71.

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5 Sawa Y，Bai HZ，Suzuki K，et al.Efficency of in vivo gene transfection into transplanted rat heart by coronary infusion of HVJ liposome〔J〕.Circulation，1995;92(2):772-82.

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7 Dohi K，Ohtaki H，Inn R，et al.Oeroxynitrite and caspase-3 expression after ischemia/reperfusion in mouse cardiac arrest model〔J〕.Acta Neurochir Suppl，2003;86:87-91.