保健灸法对更年期大鼠抗氧化能力及脑组织中p53蛋白表达的影响

王淑娟 王艳杰 石星业 宫 菲 赵 胤 (辽宁中医药大学针灸推拿学院，辽宁 沈阳 0032)

保健灸为无病而灸，未老先灸，是在具有保健功效的穴位上施灸，逐渐积累灸效，强身健体的一种方法，是中医学“治未病”的重要内容。更年期是机体走向衰老的关键启动期，在此阶段机体内环境尤其是内分泌水平急剧变化，机体组织器官逐渐衰老，稳态失衡，抗氧化能力逐渐减弱，自由基显著增多，自由基清除酶类活性下降〔1〕，出现多系统功能紊乱。本实验采用与女性更年期相近似的雌性自然老化大鼠为研究对象〔2〕，观察保健灸对自然更年期大鼠抗氧化能力及脑组织中p53蛋白的影响，以探讨保健灸法的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SD雌性大鼠42只，由北京维通利华有限公司提供，许可证号:SCXK(京2006－0009)青年组14只，3月龄，体重190～250 g;12月龄28只，体重390～450 g，随机分为保健灸组及对照组。各组动物在同等条件下常规喂养，实验室光照充足，通风良好，温度保持在(24±2)℃，湿度保持在40% ～60%。

1.2 实验方法 保健灸组动物每周灸关元、足三里4次，持续2个月，青年组及对照组每周相同时间同样抓取，但不灸，亦不让其闻到灸的味道。持续2个月。

1.3 保健灸的部位和方法 大鼠关元、足三里穴定位，参照大鼠标准穴位图谱。关元位于大鼠两后肢根部连线的中点。足三里位于大鼠膝关节后外侧，即胫骨粗隆下缘与腓骨小头下缘连线之中点处。灸前将穴区直径约1.0 cm左右的鼠毛剪干净，用自制的大鼠固定器将大鼠固定，暴露穴区皮肤。自制艾炷:底盘直径0.7 cm，艾柱直径为0.1 cm，重1.0 g，放置于带有小孔附双面胶的橡皮垫上，将橡皮垫粘贴在穴区，小孔对准穴位，点燃艾炷。灸后局部皮肤略红，无发泡。

1.4 主要仪器与试剂 TU1810PC紫外可见分光光度计(北京普析通用有限公司);RM2235型手动石蜡切片机，EG1150C型包埋机，HI1220型烘片机(德国LEICA)，BX51型OLYMPUS反射荧光显微镜(日本OLYMPUS)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。p53一抗，即用型SABC免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒(自武汉博士德生物工程有限公司)。

1.5 各组大鼠血清抗氧化相关指标检测 实验进行2个月后，各组动物禁食不禁水24 h后，每组随机抽取8只大鼠，10%水合氯醛(3.5 ml/kg体重)腹腔麻醉下，经腹主动脉采血，静置30 min后离心吸取上清，用于测定MDA及SOD。MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法测定，SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法测定〔3〕，具体操作步骤按照生化试剂盒的说明书进行。根据公式分别计算MDA含量和SOD活性。

1.6 免疫组化法检测各组大鼠脑组织p53的表达 剩余大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉，开胸暴露心脏，先以生理盐水200 ml灌至无血色后，更换4%多聚甲醛200 ml进行灌注。开颅取全脑，固定6 h以上，去除大脑额叶前6 mm和后1/2，脱水，用石蜡包埋，制作石蜡切片。p53蛋白的免疫组化染色切片中细胞核呈棕黄色的为阳性细胞。阴性对照片(PBS代替一抗)无棕黄色着色。检测大鼠脑组织p53的表达水平。依照试剂盒说明书进行操作。灰度值测定:切片染色后，选择染色良好区域，应用Leica Q550CW图像采集和分析系统，每只大鼠观察3张切片，每张切片在显微镜下(400倍)选取5个互不重叠视野，测定单位面积阳性细胞表达的灰度平均值作为其表达情况，取平均数以表示各切片蛋白的表达结果。此系统将白色灰度值设定为255，将黑色灰度值设定为0，故灰度值越高，表达越弱。

1.7 统计学方法 采用SPSS15.0软件包进行统计分析。计量资料以±s表示，组间均数比较用单因素方差分析。相关性分析采用Pearson相关分析。

2 结果

2.1 各组大鼠血清中MDA、SOD含量的比较 与青年组比较，更年期对照组大鼠血清中MDA含量明显升高，SOD活性明显下降(P＜0.01);与对照组比较，更年期保健灸组大鼠MDA含量低(P＜0.05)，SOD活性升高(P＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠血清中MDA、SOD含量变化( ± s，nmol/mgprot，n=8)

表1 各组大鼠血清中MDA、SOD含量变化( ± s，nmol/mgprot，n=8)

与青年组比较:1)P＜0.01;与对照组比较:2)P＜0.01，3)P＜0.05

8.82±1.85 156.96±2.96更年期保健灸组 14.24±2.851)2) 111.21±2.201)3)更年期对照组 21.96±2.881) 95.08±2.171)含量青年组组别 MDA含量 SOD

2.2 各组大鼠脑组织中p53蛋白表达的比较 青年组p53蛋白呈弱表达，仅见少数细胞p53蛋白表达阳性，着色较浅。与青年组相比，更年期大鼠脑组织有大量棕黄色颗粒，阳性表达细胞数显著增多。保健灸组大鼠脑组织p53蛋白表达有所上调，视野中散在棕黄色颗粒，阳性表达细胞数增多。见图1。计算机图像分析表明，更年期大鼠的脑组织中p53蛋白表达水平明显高于青年组小鼠(148.35±16.92)，表明随着年龄的增长，高表达的p53诱导了细胞的凋亡，促使机体的衰老。更年期保健灸组与对照组相比，蛋白表达明显明降低〔(132.78±13.53)、(110.66 ±15.335)，P ＜0.05〕。

图1 各组大鼠脑组织中p53蛋白表达(DAB，×400)

3 讨论

人体衰老是一个长期渐进的过程，是生命力由旺盛到衰退逐渐转变的积累过程，更年期是妇女衰老进程中的启动期，此时肾气渐亏，天癸将竭，冲任脉虚，精力体力脑力开始呈现衰退趋势，多种代谢失调，是引发慢性老年性疾病的重要时期。

保健灸为无病而灸，未老先灸。通过在具有保健功效作用的穴位上施灸，逐渐积累灸效，以达防病保健的目的。关元为任脉与足三阴经的交会穴，具有益肾生髓、温经通络、扶阳固本之效。《医学入门》载:“关元主诸虚损”，《针灸穴名解》中称此穴为“人身阴阳元气交关之处，为养生家聚气凝神之所”。该穴联系命门真阳，为阴中之阳穴。艾灸关元可补摄下焦元气，扶助机体元阴元阳，延年益寿。足三里具有温补脾胃，益气养血，扶正培元的功效。《外台秘要》云“三里养后天之气，灸三里可使元气不衰”。中医学认为“肾为先天之本”，“脾胃为后天之本”，灸关元、足三里可以达到补肾健脾、祛病延年的目的。

现代医学认为更年期阶段随着卵巢功能的衰退、体内性激素水平紊乱，脂质过氧化作用增强，自由基清除酶超氧化物歧化酶活性下降，机体的抗氧化能力降低，影响中枢神经系统和心血管系统的功能，出现一系列下丘脑与自主神经之间平衡失调的症状，如潮热、出汗、情绪忧郁、神经过敏、失眠、疲劳等〔4〕。在衰老过程中，自由基引起大量的细胞衰老、死亡，资料表明这些细胞的衰老、死亡多属于自由基引发的细胞凋亡〔5〕。MDA是机体内脂质过氧化反应的重要代谢产物，对细胞具有严重的毒性作用，血清中MDA的含量可以反映机体内脂质过氧化程度，间接反映细胞损伤的程度。SOD是广泛存在于生物体内的重要抗氧化酶，其活性与年龄密切相关，随着增龄，体内的SOD活性逐渐降低，清除自由基的能力逐渐减弱，使自由基在体内堆积，进一步加快老化的进程〔6〕。

艾灸具有较强的抗自由基损伤和抗脂质过氧化损伤的作用〔7，8〕。本实验结果说明更年期大鼠机体内酶防御系统活性下降，清除氧自由基的能力降低，自由基代谢出现紊乱。而保健灸组大鼠与对照组比较，血清中MDA含量显著降低，SOD活性增高，表明保健灸可增强更年期大鼠清除自由基的能力，降低机体内脂质过氧化反应物，从而达到延缓衰老的目的。

p53是调控细胞凋亡的重要蛋白因子，参与DNA损伤修复、细胞周期调控、细胞凋亡等过程。p53可以直接激活线粒体凋亡途径导致细胞凋亡。正常情况下p53蛋白以潜在形式存在并维持低水平，p53过度表达可引起细胞的衰老〔9，10〕。本实验结果表明随着月龄的增长，p53蛋白表达升高，高表达的p53诱导了细胞的凋亡，促使机体衰老。而保健灸组大鼠脑组织中p53蛋白表达水平明显低于对照组，提示保健灸法对增龄导致的p53蛋白表达增高具有一定的拮抗作用，并且p53表达下调与抗氧化作用同步。研究表明自由基过量会刺激细胞凋亡〔11〕，为此可以推断保健灸法是通过增强了机体清除自由基的能力，一定程度抑制细胞的凋亡，从而反馈性下调了p53蛋白表达。

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9 许少峰，付 丽.p53研究的新进展〔J〕.中华病理学杂志，2004;33(6):559.

10 朱燕珍.电针治疗血管性痴呆大鼠对海马CA1区P53表达的影响〔J〕. 福建中医药，2007;38(2):45－6.

11 Yand E，Korsmeyer SJ.Molecular mechanism of apoptosis:adiscourse on the bcl－2 family and cell death〔J〕.Blood，1996;88(2):386.