导痰汤对颈动脉硬化家兔内皮细胞黏附分子-1及p53表达的影响

陈文强 黄小波 李宗信 王 芬 王宁群 (首都医科大学宣武医院，北京 00053)

颈动脉硬化在脑梗死的发生中发挥重要作用〔1〕。颈动脉硬化过程中，细胞间黏附分子-1(ICAM-1)介导的炎症反应在颈动脉粥样硬化的发生发展中起了极其重要的作用〔2〕，而ICAM-1的表达则与p53的调控密切相关〔3〕。导痰汤作为临床常用化痰名方，能够燥湿化痰，行气开郁。目前临床上经常使用导痰汤进行头晕治疗，并取得了较好的疗效。本课题组在体外实验中发现导痰汤能够有效抑制内皮细胞ICAM-1表达〔4〕。但是，对于导痰汤治疗动脉粥样硬化机制研究的报道较少，妨碍了其临床疗效的验证和进一步推广。因此，我们将通过动物实验，进一步研究导痰汤是否能通过干预ICAM-1和p53通路的途径而用于治疗颈动脉粥样硬化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性新西兰白兔，体重2～2.2 kg，购自北京开源兔业养殖场(SCXK(京)2006-0005)。

1.2 制备导痰汤 按照《济生方》中导痰汤的配伍比例:半夏9 g，南星 3 g，茯苓 3 g，炒枳实3 g，橘红3 g，甘草2 g，生姜3 g。参照《中国药典》(2000年版)，蒸馏水泡2 h，常法煎煮2次，每次40 min，滤出，60℃恒温箱内24 h，水浴蒸发浓缩至100%，4℃储存备用。

1.3 实验动物分组 新西兰白兔造模前以基础饲料适应性喂养1 w，在稳定其血脂水平和代谢状况后，按照随机数字表法分为正常对照组(A组，5只)、模型组(B组，5只)、导痰汤治疗组(C组，15只，分为大、中、小剂量组，每组5只，使用中药灌胃，)共3组。A组给予基础饲料喂饲;B、C组予以高脂饲料喂饲。高脂饲料配方(质量分数:2%胆固醇+2%猪油+96%基础饲料)。B、C组动物在喂饲1 w后实施颈动脉内膜空气干燥术，术后C组家兔喂饲导痰汤4 w，分别按照10，8，6 ml/kg，使用导痰汤灌胃，每日给药1次。所有动物均单笼喂饲，饮水不限，每日每只进食150 g饲料。

1.4 颈总动脉内膜空气干燥术 10%的水合氯醛(剂量为5 ml/kg)灌肠后，颈部脱毛消毒;颈部正中纵行切口，钝性分离，暴露两侧颈总动脉，分离右侧颈总动脉，长度约2 cm;用动脉夹临时夹闭右侧颈总动脉近心端和远心端后用皮试针头于近心端夹闭外近刺入管腔，再在远心端刺破颈总动脉;将抽有生理盐水的注射器连接于皮试针头，用生理盐水灌洗血管腔，然后将医用氮气连接于皮试针头向夹闭段的颈总动脉行空气干燥术，以120 ml/min进行干燥，时间10 min;干燥术后拔出皮试针头，松开动脉夹，恢复右侧颈总动脉的血流，用棉签轻压伤口，待完全止血后去掉棉签，轻压2 min;待颈总动脉完全止血且血流通畅后用庆大霉素局部抗感染，并缝合皮肤。

1.5 HE染色观察颈动脉病理改变 每组每只家兔所取的右侧颈动脉截取远端1 cm，中性缓冲甲醛(pH7.4)固定24 h后取材脱水，石蜡包埋固定，4 μm厚连续切片，60℃ ～62℃烘箱(DHG-9140A型电热恒温箱)烤片2 h后行HE染色。每组每个标本随机选取1张切片，观察病理改变。

1.6 免疫组织化学染色 每组每个标本随机取5张石蜡切片，应用免疫组化SABC法(免疫组化PV 9000试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，参照试剂盒说明书操作。阳性着色为内皮表面棕褐色反应产物沉积，呈胞浆染色，以PBS代替一抗作空白对照组。每张切片随机选取3个视野(400倍)，计算机图像扫描定量分析平均光密度(OD)值。

1.7 统计学分析 使用SPSS13.0软件进行分析，实验结果以±s表示，组间比较使用单因素方差分析，p53与ICAM-1相关性使用相关分析。

2 结果

2.1 颈动脉HE染色结果 正常对照组颈动脉血管内膜完整，中膜为梭形平滑肌细胞。模型组有粥样斑块形成，内膜明显增厚，内膜下有大量泡沫细胞堆积;导痰汤干预组内膜也有轻度的增生，内膜下有少量的泡沫细胞形成，程度轻于模型组(图1)，表明颈动脉粥样硬化模型制作成功，导痰汤对颈动脉粥样硬化具有一定的干预作用。

2.2 颈动脉免疫组织化学染色结果 正常对照组血管壁有少量ICAM-1和p53阳性表达细胞。模型组血管壁内皮细胞的胞浆中有ICAM-1和 p53强阳性表达，显著高于对照组(P＜0.01)。导痰汤治疗组细胞内ICAM-1和p53阳性表达显著低于模型组(表1，图 1，P＜0.01)，且大剂量组的导痰汤对ICAM-1和p53的抑制均显著强于小剂量组(P＜0.01)。

2.3 p53与ICAM-1相关分析 直线相关分析结果表明，p53与ICAM-1水平呈显著正相关(r=0.809，P＜0.01)。

表1 导痰汤对颈动脉硬化家兔ICAM-1和p53表达的影响(±s，n=5)

表1 导痰汤对颈动脉硬化家兔ICAM-1和p53表达的影响(±s，n=5)

与对照组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.01;与小剂量组比较:3)P＜0.05

组别ICAM-1 p53对照组0.037±0.005 0.082±0.015模型组 0.200±0.0351) 0.219±0.0651)导痰汤干预组小剂量组 0.166±0.0432) 0.179±0.048中剂量组 0.104±0.0112)3) 0.135±0.0222)大剂量组 0.098±0.0102)3) 0.123±0.0082)3)F值 31.328 9.502 P值 ＜0.01 ＜0.01

图1 各组家兔ICAM-1和p53表达的影响(×400)

3 讨论

动脉粥样硬化的病因尚未完全阐明，流行病学调查显示其主要危险因素与年龄、性别、高脂血症、高血压、吸烟、糖尿病等有关。目前普遍认为动脉粥样硬化的发生是由于致伤因素和血管反应之间复杂的相互作用的结果〔5〕。

ICAM-1属于免疫球蛋白超家族，是内皮细胞活化标志之一，在中性粒细胞迁移和内皮细胞黏附致动脉硬化过程中起重要作用〔6〕。单核细胞在血管内皮黏附并向内皮下迁移和泡沫化，是动脉粥样硬化早期的病理过程〔7〕。ICAM-1几乎参与了单核细胞黏附和迁移转化的全过程，促进和加速了动脉粥样硬化的发生和发展，与动脉硬化的发生、发展有重要关系〔8〕。在颈动脉粥样硬化等老年性疾病发病中，ICAM-1的表达可以在细胞内的多个环节上受到调控，其中p53表达异常可以直接诱导内皮细胞ICAM-1过表达〔9〕。由于细胞衰老是生物衰老的基本单位，并参与生物体衰老的整体进程，也是人类颈动脉粥样硬化等老年病发病的共同基础，而p53抑癌基因是细胞衰老的关键效应物，作为诱发人类细胞衰老刺激信号的重要诱导途径，p53通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡和促进DNA修复而成为细胞衰老遗传控制程序中的主要环节，并在颈动脉硬化等衰老相关疾病中扮演了重要角色〔10〕。导痰汤可以有效抑制颈动脉硬化过程中内皮细胞ICAM-1和p53的表达，表明导痰汤可能通过抑制p53这一途径而调控ICAM-1的表达。这也可能是临床上导痰汤可以治疗动脉硬化的一个内在机制。

中医经典文献中没有动脉粥样硬化的记载，但根据其典型临床表现应属于“眩晕”、“头痛”等范畴。认为系水谷精微由清化浊，变生痰浊，留滞血脉之中，凝聚成块，如《医学正传》云:“津液稠黏，为痰为饮，积久渗入脉中，血为之浊”。另一方面，痰借血体，血借痰凝，痰瘀互结，凝于血脉，日久胶结不解，如《血证论》中云:“血积既久，亦能化为痰水”。因此，痰浊内阻是动脉粥样硬化的一个重要病理基础和致病因素〔11〕。临床上则根据“无痰不作眩”等病机理论，将化痰法在动脉粥样硬化治疗中加以运用，取得了一定的疗效。导痰汤作为临床常用化痰名方，能够燥湿化痰，行气开郁。目前临床上经常使用导痰汤进行降脂治疗，并取得了较好的疗效〔12，13〕。导痰汤中的主要成分南星、枳实、半夏、陈皮具有抗氧化、抗凝、降血脂等作用〔14，15〕，对动脉硬化具有较好的治疗作用。由于中药复方成分复杂，所以具体的作用机制尚有待于进一步研究。但现有研究表明，半夏和陈皮作为导痰汤中的主药，两者的主要成分分别是β-谷甾醇和陈皮苷，而这两者均能抑制黄嘌呤氧化酶/次黄嘌呤体系中产生的超氧阴离子，其清除自由基能力在一定浓度范围随着药物浓度的增大而增强，且β谷甾醇和陈皮苷具有明显的协同作用〔16〕。由于β谷甾醇和陈皮苷是良好的抗氧化剂，能较好地清除自由基，而自由基与p53表达密切密切相关，并与衰老、炎性反应和动脉粥样硬化等有关〔17〕;而且β-谷甾醇和陈皮苷均有较好的抗炎性反应的作用〔18，19〕。

本结果说明随着导痰汤浓度的增加，其药效呈剂量依赖性。但值得注意的是，导痰汤中的主要成分半夏和南星均有一定的毒性。其中，半夏全株有毒，块茎毒性较大，临床上常使用的法半夏，经过炮制毒性较小，但过量服用也可能对口腔、喉头、消化道黏膜的强烈刺激;而大剂量使用南星则可导致呼吸道平滑肌水肿。因此，在追求提高临床疗效的同时，需要在中医理论指导下，合理配伍和炮制，注意降低中药的不良反应。

另外，ICAM-1分布于细胞表面和细胞间基质，在动脉粥样硬化过程中，以受体-配体形式发挥作用，介导细胞与细胞间，细胞与基质间或细胞-基质-细胞间的黏附，参与细胞的信号传递与活化，炎性反应等一系列重要生理和病理过程。这与痰性黏滞，易阻碍气机，流窜周身的特性有一定的相似性。而以燥湿化痰为主要功用的导痰汤可有效抑制ICAM-1在体外培养内皮细胞中的表达。

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